PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）コミュのRealTime-RTPCRについて。

1）スタンダードカーブを描くためのテンプレートですが、みなさんどういったもの使われます？
目的遺伝子が入ったプラスミドで正解?

2）希釈系列はどのくらいの倍率でどれくらいの本数とりますか？

3）同サンプルで2本流した際、何％くらい振れますか？
また、何％未満なら適正と判断できますか？
（ABI7300、標準プロトコルで適当なハウスキーピングジーンとった場合）

コメント(5)

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[2] mixiユーザー 05月28日 15:14

1）はそれでも正解だと思います。何か市販されている既知濃度のものがあったらそれでもOKです！ですが、プラスミドなのでDNAですよね？なので厳密にはone stepでのRT-PCRを反映しているものではありません。

2）はあまりに希釈が小さすぎてもむやみやたらにそんなに変わらないCt値をとるだけですから、最低でもCt値が2は変わる4倍当たり以上じゃないでしょうか？

3）これは本当に人それぞれです。ですが一般的に実験として成り立っている評価としてはCV値10%というイメージがありますのでそれを目標にする感じでしょうか？

答えになってますかね？

[3] mixiユーザー 05月30日 20:40

＞ソルティアンさん

SYBRGreen系ならそんなに高くはならない…かもしれませんけど、プローブ系は高いですよー。目的遺伝子ごとに別のものを頼まないといけませんし。

多検体処理するには「勇気」が必要です（笑

＞ケンジさん

ありがとうございますー。参考になりました。
現在やってることで、問題なさそうです（^^;

３）で１０％とありますが、SYBRGreenでも調子良いと５％未満で収まるんですが、たまにハズレがでます。プローブ使う系のほうがハズレは少ないですが。

Rocheが配列公開の加水分解プローブを出していますが、色素が一種類なんでマルチプレックスできないんですよね。

配列公開じゃないABIは何かキモチワルイですし…

配列公開で、各種色素のプローブ作ってくれる所ってご存じないでしょうか？？

[4] mixiユーザー 06月02日 09:01

>まーぅさん

自分ではSYBRではCtが0.5ずれ以内を使用するようにしています。tripricateでやってはずれを省いています。

ABIの配列非公開にたいする気持ち悪さをもっているとはなかなかいいセンスですね（笑

プローブは言ってしまえば5'と3'に修飾をつけられるといいだけなので、invitrogenやSIGMA Genosysなどでできると思いますよ！

[5] mixiユーザー 06月05日 02:39

3本でハズレ省いてですか…省くのはあんまり考えてませんでしたね。
でもやっぱり3本ですよね。2本じゃ心許ないか（^^;

＞ABIの配列非公開にたいする気持ち悪さをもっているとはなかなかいいセンスですね（笑
そうですかー？？

どこで増やしてどこにくっついてるかわからんようなもんでは、いくらプローブ本体の特異性が高かろうと意味がない気がしてまして。数字だけで満足する人は別に気にしないんでしょうが。

ワタシは気にします。ハイ。（笑

ＲＯＣＨＥの「ユニバーサルプローブ」は以前から知っててサンプル依頼もしたのですが、インビとシグマでカスタムのプローブあったんですね！！
今調べて初めて知りました（^^;

ちょろっと見た感じ、インビの「ＬＵＸ」よりもシグマの「普通の」プローブのほうがよさそうです。

１）ＲＯＣＨＥのプローブは蛍光が1種類のみしか無い（はず。）ので、使いにくい。
２）まぁまず無いとは思いますが、他の遺伝子で使いまわせる可能性があるｗ（この点はユニバーサルプローブも同じですが）
３）「ＢＨＱ１」が気になります。面白そうです（笑
４）何といっても安いですねー。半オーダーのＲＯＣＨＥよりも安いとはｗ
５）「ＬＵＸ」と「普通のプローブ」で同じような値段になるなら、「手軽さ」よりも「感度・特異性」優先ですね。Ｔｍ測定は捨てがたいですが…どーしても気になるなら終わってからＡＧＥてＳＹＢＲか何かで染めたら良いでしょうし。

最後になりましたが、情報ありがとうございましたm(_ _)m

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