[mixi]【共通トピック】お悩み相談はこちらにどう - PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）

[8] mixiユーザー 10月26日 21:10

エリカさん　はじめまして

>なぜか2ndになると姿を消すんです！

この段階で一番考えられるのは「プライマーが壊れて無くなっている」という問題だと思います。しかも、ポジティブすら増えていない現状のご様子。

そして、また考えられるのは「プライマー配列の不存在」ですね。
配列的にくっつきにくいのかもしれないですし、１stで拾ってきたものの中の2nd配列含有率が極端に少なくなっているなど
様々考えられます。実験は目には見えないモノを扱ってるため、一つずつ潰していくしかないんですよね。

ここで一つ不思議な話

ある先輩が当たり前のように結果を出していた方法でその人以外のラボメイツが実験を同様に行っても、全く持ってポジティブが出ない。
きっと実験というのは癖みたいなものがあるんでしょうか？

[9] mixiユーザー 10月26日 23:00

エリカさん、はじめまして。

二段階のPCRをなさっているみたいですね。
第一段階と第二段階のプライマーセットは、おなじものですか、それとも、違うものですか？

もしも、おなじものであった場合、

（つまり、全く同じ条件のPCRを２回やって、
その分だけ産物を増やそうという意図）

ちょっと思いあたるふしがあります。

というのは、まったく同じ条件で、同じプライマーを使うと、
PCRって増えないことがあります。

だから、産物の内側にあることがわかっているプライマーを使ってPCRをしなおしたりしますが。
（ネステッドPCRってやつですね）

参考になれば。

[12] mixiユーザー 11月08日 02:59

miRNAのRealtimePCRについてですが、スタンダードとしてハウスキーピング遺伝子がないので安定したコピー数を得るためには工夫が要ります。
これからされる方は、その辺を考慮に入れてやられるといいとおもいます。

[14] mixiユーザー 08月19日 12:40

プライマーの5'側にSal1、3'側にNot1サイトを加えて、
KOD＋ Ver.2で増幅した後、A付加してpTA2ベクターにTAクローニングしたのですが…

シーケンスかけたところ、Sal1サイトが付かず、templateのプロモーター領域が入ってました　(;´Д`)

何が原因なんでしょうか？？？

[15] mixiユーザー 08月19日 13:43

プライマー配列に問題がないのでしたら、たまたまでしょう

そのクローンをテンプレートに増やし直したら？

[16] mixiユーザー 09月02日 02:12

同じマスターミックスで同じものをn=4でＰＣＲしているのに、結果がばらつきます。もう６回ぐらいやってて、どの回もダメでした。

熟練者がやるとすごくきれいにいきます。

月曜日ももう一回同じことやります。でも、なにが原因かよくわからないのに、繰り返すのが気が重いです。

しいて言えば、時間がかかりすぎてるからかとおもってとりあえず次はスピードアップと冷やすことを心がけることにしました。

このほかに注意すべきことってありますか??

アドバイス宜しくおねがいします

[17] mixiユーザー 09月02日 06:18

ハイジ☆ハイジさん、こんにちは。

なぜだかわからないけど熟練者がやるとうまくいくというのはありますよね。あれはほんとうにフシギ。

ばらつきですが、サーマルサイクラーの穴ごとに温度特性が微妙に違うということを聞いたことがあります。外側（外周）はうまくいかないから、内側をつかえと言われました。

あとはサンプルを（手早く）よく混ぜるとか？

[18] mixiユーザー 09月02日 12:36

ハマジさん、アドバイスどうもありがとうございます。

穴ですね。。。熟練者も同じの使ってるけど、私はﾏｼﾝに拒否されてたりして

あと、時間のかかりすぎも問題ですかね･･･。
実は、試薬調整から終わりまで、熟練者は２０～３０分ぐらいで終わるところを、ハイジは１時間かかってるんです。

プロトコールも叩き込んで、ｲﾒﾄﾚもして･･･だけどもうミスしたくない！！とおもっていちいち工程をチェックして遅くなっているような。

[19] mixiユーザー 09月02日 17:02

ハイジ☆ハイジさん、こんにちは

当方も始めた当初３週間ＰＣＲが増えなかった経験があります

あの頃は本当に切なかったです

さてさて時間は確かに大きく結果を左右します
サンプル数がどのくらいあるかは判りませんが
１min/sampleでも掛かりすぎだと思っていただいてかまわないと思います
あとは酵素を入れる順とかですかねぇ

そして不思議な経験則になってしまうのですが
「成功のイメージを持つ事」
「あまり丁寧にやらず適度にいい加減にやる事」

丁寧にやりすぎた実験ってあまり上手くいった覚えが無いのです

[20] mixiユーザー 09月02日 17:13

ワニさん

･･･本当ですか。１サンプル１分。
わかりました。心して取り組みます。アドバイスどうもありがとうございました。

イメージ･･･そうなんですよぉ。
本当になりそうだから言わないようにしてたんですけど、いっちゃうと、ぜんぜんできる気がしません!!!!!!!!!!!

いまから明日の開始時刻まで何とか頭の中を成功イメージで満たそうと努力してみます。

[21] mixiユーザー 11月08日 23:48

はじめまして
最近やたらと　PCRばっかりやっている　リョウ　と申します

どうしても　GC含量の多い領域を増やさなくては　ならないのですが
専用のtaqを使っても　DMSOを加えても　上手くいきません

Primerを変更してもダメ･･･非特異ばかり･･･

どなたか　アドバイスをお願いします!

[22] mixiユーザー 11月09日 00:19

>りょうさん

僕の中では、DMSOはあまり効果なし？？です。

taqは何をお使いですか？？

TAKARAのLA taq with GCだったら大抵は平気だと思います。
自分もGCリッチな領域を解析しているのですが、LA taq with GCなら増やせない遺伝子はありませんでした。
あと、TOYOBOのKOD Plusとかも良かったですが、Aが付加しないので、
TAクローニングするには、Aを付加しなきゃ駄目です。

アニーリングは何度位でしょう？？

今のプログラムから2度刻みくらいで上げってみたらどうですかね。

しかし、

非特異的バンドが多いなら、プライマーが一番問題な気がします。

GCリッチな部位へプライマーを作らずに、周りの少なめなところで作製し、
ロングで増やすとかも良いかもしれません。

あまり、お役に立てそうも無いコメントでスイマセン。

[23] mixiユーザー 11月12日 12:43

>ドルガバさん
　アドバイスありがとうございます!!
TAKARAのLA taq with GC　も使ってみたのですが　ダメでした。

アニーリングは98℃です

やはりプライマーに問題が有る気がするので　設計しなおそうと思います。

[24] mixiユーザー 11月25日 18:59

＞りょうさん
解決済みならごめんなさい
GC含有量の多い配列の解析をしている者です。
様々な酵素を使いましたが、KOD-plus-が一番効率よく伸びました。
僕の中ではDIMSOよりも、ホルムアミドの方が効果ありでした。
KOD-plus-も通常条件では伸びませんでしたが、終濃度4~6%のホルムアミドで見違えるような結果になりました。
また、アーティファクトが消え、良好な結果が得られました。
経験上KOD-plus-はホルムアミド終濃度8%までは反応をほとんど阻害しません。
アニーリング温度はprimerに記載しているTm値で行っています。

お使いになっている酵素が何か分かりませんが、よかったら試してみてはいかがでしょうか。

[25] mixiユーザー 11月25日 19:27

＞りょうさん
アニーリングとは「熱変成で１本鎖にしたテンプレートＤＮＡにプライマーを結合させる時の段階」を指します。
したがって98℃というのはアニーリングの前のディナチュレートの温度ではないでしょうか？

ＰＣＲの標準的なサイクルは
熱変成　95℃近辺
アニーリング　45℃～65℃
伸長　72℃
であったと思います。

[26] mixiユーザー 01月12日 05:29

こんにちは!!

今、骨再生の関係の実験で毎日PCRばっかりやってますが、最近比較用のGAPDHが増えてくれません

しかも不思議なことに、かつて予備実験として同じ条件でやってみたときや、新しいプライマーが届いて試してみるときなどはきちんと出るのですが、いざデータを取ろうとするととたんに出なくなります

皆さんはこんなことありますか？もしあったならばその時、どう解決したか教えてください。是非参考にしたいと思います。

あと、ふと思ったんですが各試薬って入れる前にポンピングするべきなんですか？
最近入れる分量を正確にしようと、出来るだけチップの先を試薬に浸けないようにしているのでモノによっては上澄み(？)だけ吸ってるのかなと思いました。

あまりに初歩的な疑問と思いますが、最近やっとぺピットマンの使い方を覚えた研究超初心者です。是非皆さんの智恵を貸してください。

[28] mixiユーザー 01月28日 19:04

こんにちは☆
ずっとＰＣＲを失敗し続けてて悩んでます

全く同じ機械で、同じ条件でやったのに、前の実験の再現性がとれなくて・・・
原因が試薬かと思い新しいのに変えてみたりしたのですが
全然変わらなくて。。
原因がさっぱりわかりません泣

チョコパッションさんの質問とかぶっちゃうんですが、
こんな風に再現性とれなくなったことがあるか、私も是非聞きたいです！！

あと、これからRT-PCRをしなきゃいけないんですが
まずはPrimerチェックとして、ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲしてるんです。
ここで、そのPrimerによって増え具合が違う場合、
このままRT-PCRしたら、この差って問題あるのでしょうか？

極端に違ったら問題あると思うのですが・・・
皆さんはこのような違いは考慮してやっているのですか？？

[29] mixiユーザー 01月28日 23:38

再現性について、私のどうしようもなくくだらない失敗例述べますね。

１～２ヶ月ぐらいＰＣＲの再現性が全くなくて困ってた時期がありましたよ。
いろいろと原因を探って見たりしたんですがどうも納得がいかない。

で、原因は何と「ゲル」でした。
うちのラボだとMupid用のアガロースゲルは「減ってきたら室員が適宜作る」方式を取っていたのですが、
その作り方がテキトーなスタッフがいて、ダメなゲルで結果をみてたことがありました。
自分で作ったゲルを自分で使うようにしたら結果が驚くほど安定しましたとも。EtBrも然り。

アガロースゲル溶液は表面張力と粘性が強く、コーム周辺や端っこが盛り上がるので泳動の結果を見たいゲルの中域あたりが窪みになります。とくにゲル溶液をケチってゲルを作ると致命的になって、ウェルの穴よりも薄いゲルが出来てしまったりします（写真の図）。

あまりにもくだらないイージーミスなので恥ずかしいですが･･･

[30] mixiユーザー 03月27日 22:25

はじめまして。大学三年で今卒論研究しているのですがどうしてもTAIL-PCRがうまくいきません。
目的位置より200bp上流でプライマーが着かないはずの位置から増幅されてしまいます。何がいけないのでしょうか？
一緒に考えてもらえたらうれしいです。

[31] mixiユーザー 04月03日 05:50

始めまして、t-dogといいます。大学の研究でnovel gene（黄色ブドウ球菌から）を大腸菌にクローンする為、PCRを試みています。なかなかPCRが成功しないので悩んでいます。
この研究は前の卒業生の研究の続き、と言うこともあって、プライマーデザインはもうできています。（Tm64度 downと、Tm59度 upです)
実験の引継ぎが上手くいってないのか、増えません。
前卒業生の成果を見ると、taq pfuでは、pfuのみアニーリング53度で微かに増幅しています。
ちなみにその卒業生とは連絡が取れないんです。
同じ温度、設定でtaqを使ってやってみましたが、増えませんでした（当たり前？）。また他にもアニーリングを53-60度までのシリーズで１度ずつ変えてみましたが、やはり増えません。
他のポジティブコントロール（PCRキットに入ってるやつ、別のターゲットのあるプライマー←意味通じるかな？）は、バンドが確認できます。
ゲル上では、プライマーが下の方でバンドを作っていて、他に非特異のバンドすら見えません。それは、プライマーがテンプレートDNAに全くバインドしていないと言う事だと思うのですが、
僕のラボではtaqのみでPCRを行ってるので、pfuでないと増幅しないんではないか、という話になっています。
しかし、全くこのプライマーがDNAにバインドしない事を考えると、pfuにしても効果が期待されるのが半信半疑です。（pfuのセットが今なく、購入するのに迷っています）pfuはプルーフリーディングなどtaqとは少し違った性質があるのは分かるのですが、なぜ試薬を変えるとPCRが成功するときがあるのでしょうか？

話が長く、質問の要点がごっちゃになってしまいましたが、
状況；
1.Novel geneは一度はPCR pfu　を使って確認されている（アニーリング53度）
2.同じ事をtaq (promega)でやり、アニーリングの温度などを調整してみたが増幅しない
3.他のポジティブ、プライマーknow gene　は増幅できているので、マシン、試薬、DNAなどには問題なさそう？
4.プライマーがゲルの一番下でバンドとして確認できる（プライマーが反応していない？）
質問；
1.一番の原因はtaq なのでしょうか？それ以前に初歩的な問題はないでしょうか？
2.taq やpfuを使い分ける必要性はなんでしょうか？　僕の場合も（プライマーがDNAにバインドしていない）もpfu に変えることは効果的でしょうか？

一度pfuで結果が出てるんだから、とりあえずそれでやったら？
と思いかも知れませんが、
プライマーがtaq pfu でテンプレートDNAに結合したりしなかったりするものなのか、そのメカニズムが知りたいので、知ってる方がいましたら是非教えてください！
よろしくお願いします。

[32] mixiユーザー 04月18日 00:07

T-dogさん

Pfuで増えたのならば、Taqにこだわる必要があるのでしょうか？
先日、同じ酵素（KOD+)なのにロットが変っただけで増幅しないという困った例を見ました。ですから、PfuとTaqでは大違いです。

それから、templateは問題ないですか？
コロニーPCRならば、増えないときはゲノムを取るのも一つの手です。
特に黄ブみたいに壊れ難い菌は。

プライマーは分解していないですか？新しく希釈し直しましたか？

一番恐ろしいこと…前任者の結果はreliableですか？　つまり目的のNovel geneは本当にあるのかどうか？「Novel geneは一度はPCR pfuを使って確認されている」とのことですが、これはご自分の実験でしょうか？

基礎的なことばかり書きました。
そんなことはとっくに全て検証している！と立腹されないで下さいね。

[33] mixiユーザー 05月16日 23:21

WAKAさん
返答ありがとうどがいます！

プライマーを希釈し直して試してみました。
するとＰｆｕの方は増えました！
あと、ゲノムの方はもう一度純度を確かめてみたところ問題なさそうです。

はい、以前のpfuの実験は、僕自身の実験ではなく、その頃僕のラボにいた、
生徒の授業プロジェクトの物でした。

それから、もう一度、一から全てやり直す必要がありますね＞＜
自分で全部揃えなかったのがいけないようです。

pfuは高いので、僕のラボで一般に使われているtaqを使いたかったのですが、
pfuで増やす事が出来るのが分かったので、そちらで増やす事にします。

お返事遅れてすみませんでした。
ありがとうございます！

[34] mixiユーザー 05月18日 20:57

セバスさん

質問についてなのですがもう少し情報があると答えやすいです。
T-dogさんのように、何のDNAを増やしたい？どのように抽出されたものか？長さは？使っているキット(酵素)は？などなど。

お願いしますね
(●´∀｀●)

[37] mixiユーザー 01月14日 23:37

こんばんわ、エリといいます。
少し毛色が違うとは思いますが、質問させてください。

ただいま大学3年生です。
卒業後は院に進学したいと思っていますが、
どこに行こうかがまったく定まりません。
｢遺伝子｣学よりも、遺伝学、育種学をやりたいと思っています。

みなさん、どこかお勧めのところがあれば教えてください。
おねがいしますm（__）m

[38] mixiユーザー 01月19日 22:17

エリさん

某大学で博士課程兼助手をやっています。
大学院への進学大変良いと思います。

僕が大学院への進学を決めたのは、具体的に○○学がやりたかったからという訳ではありませんでした。
どんな研究内容に惹かれたか、といった要因の方が強かったです。
遺伝学、育種学と言っても、多岐にわたり、研究室で行っている内容は様々です。
まずはどのような研究をやって行きたいのかもう少し具体的に纏める必要があります。
それには論文を読むのが一番早いと思います。
後はHPを作っているとことならHPを参考にするとか、もう少し焦点を絞りましょう。

[39] mixiユーザー 01月25日 17:43

georgeさん

ありがとうございます。
いろいろ見ていこうと思います。

[41] mixiユーザー 01月14日 22:17

ミソハチさん

Taqの失活…　あまり聞きませんね。
使う前に手ではじいて混ぜていますか？ボルテックスは使わないで下さいね。
その他のバッファーやdNTP, MgCl2なども使用前によく混ぜていますか？
凍っているものを溶かした直後は、均一になっていませんよ。
基本ですが、確認してみて下さい。

[43] mixiユーザー 01月25日 14:42

はじめまして。某大学4年の学生です。
PCR-RFLPに使用するプライマーついて教えてください。
使用しているプライマーには人為的にミスマッチ配列を施したプライマーを使用しています。ミスマッチを導入する意味がさっぱり解かりません。どうかアドバイス又は理解しやすいサイト等がありましたら御願い致します。

[47] mixiユーザー 05月07日 23:52

現在、GCリッチな遺伝子のシーケンシングを行っていますが、200bpくらいしか読めず困っています。GCリッチな遺伝子のシーケンシングを行う際のアドバイスを頂きたいです。
反応液に(最終濃度5%)DMSOを加え、酵素量を増やしたのですが目立った改善は観られませんでした。
Big Dyeを使用し、サイクルPCRの反応条件は98℃ 3min→98℃ 10sec 50℃ 5sec 60℃ 4min（30cycles）で行っています。
よろしくお願いします。

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