PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）コミュのリアルタイムPCRの誤差

リアルタイムPCRについて質問です

現在発現解析を行っているわけですが、標準誤差が大きくなるのに悩んでいます。
また、同じサンプルを使っても同じデータが得られません

原因は何でしょう？
先生との話し合いでは、RNAのDNase処理に問題があるのでは？となりましたが…

みなさん、リアルタイムの結果の誤差は大きいものですか

コメント(3)

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ＤＮase処理云々もあるかもしれませんが、なにより手技によるところが大きいと思います。
色素の発光量をみてるだけの大雑把な分析法ですし。（特にSYBRは）

同じサンプルを１０ウェルとか流してみて、自分の腕を見てみては？
ピペット使うのが上手い人は結構正確にデータでます。
（５％未満とか？遺伝子の量によって、どの辺が基準になるかはわかりませんが）

リアルタイムの正確性って、要はどれだけ正確に各ウェルに分注できるかというところです。
これをクリアした上でサンプルのトラブルシュートに移らないと、話がこんがらがってしまします。

ちなみに「RNAのDNase処理に問題がある」場合って
・ゲノム残留でゲノミックな産物が出来てる
・処理時のRNaseコンタミによるサンプル分解
くらいですね。
でもこれでは同サンプルで検出量が振れる場合の理由にはなりえませんよね。

あと定量するんだから検量線が最重要です。
これがキッチリ引けない場合はデータになりません。
自分は4-5ポイントのduplicateとかで引いてました。
（相関係数0.999くらいは出てたような。前のことなのであんまり定かではないですが）

[2] mixiユーザー 11月29日 23:58

標準誤差、私も悩まされました