生物学コミュの助けてください！！

自分は都内の大学に通う学部４年です。現在テロメラーゼ活性の検出の実験を行っています。うちの研究室はまだ立ち上がったばっかりでまだ研究が進んでいません。

自分は大腸癌細胞株colo201細胞と胃癌細胞株MKN45細胞を飼っていて実験に使っています。

現在、この2つの細胞からテロメラーゼ活性をTRAP法をもちいて測定しています。
しかし、8月にテロメラーゼ活性のきれいなバンドがでたのを最後に一回もでません。。。

どなたかテロメラーゼ活性を研究してる方、お力お貸しください。

バンドがでないので、

1抽出をしなおした（実験のたびに）
2SDS-PAGEではタンパクは抽出できているのを確認
3TRAP bufferはきちんとPCRがかかっている
4RNAse,Protenase 両方のインヒビターをいれている
5温度には気をつけ蛋白質は変性してないとおもわれる
6プライマーはキットのRPプライマー使用
7TRAP buffer,CHAPS bufferは自分で作っているが、一ヶ月に一回は作りなおしている（濃度のミスはない）
8PCRサイクルや伸長反応させる時間はキットと同じ

と、いう風に実験を行っています。教授曰く何か変えれば必ず出るといっております。どなたかアドバイスをいただけたら光栄です。よろしくお願いします。

コメント(3)

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[1] mixiユーザー 01月19日 20:05

僕はこの実験をしたことがありません。
でも自分でタンパク質の結合や活性のアッセイ系をつくって、実験をそこそこしています。

そういう経験から云々することはできませんが、
うまく行かない理由として
その１。うまく行ったときの細胞の状態（細胞数や接着性など）と同じ条件で細胞の処理を行なっているのか？
その2。テロメラーゼが本当に発現しているのか（他の方法で分析できたらウエスタンブロットやPCRでテロメラーゼの存在を調べる、でも抗体や他の準備でこれは大変ですね）
その3。細胞の状態はつねに変わるし、テロメアの状態も変わるから、PCRの反応条件をカエてみる。ちょっとしたことが検出の妨害になります。サーマルサイクラーを最初から変性温度にしてからPCRをおこなうとか。。アニーリングの温度を変えてみる（出なければ低温にしてみるのがいいのかな。。）あと塩化マグネシウムの濃度を上げてみるとか。。

タンパク抽出に問題がなければ、PCRの条件をゆるゆるに変更すれば、なにかバンドみたいなものが出てくるでしょう。そうしたら、PCRの反応条件をキツくすればいいでしょう。

あと、タンパク質は抽出温度や保存法に敏感です。
抽出液の保存はディープフリーザーがいいです。抽出液は普通の制限酵素のように扱うと天国に召される可能性があります。
心配なら抽出液を小分けして、液体窒素で瞬間凍結してディープフリーザーに入れましょう。そして溶かしたら使いきりです。

あとは慣れです。手際が良くなると結果がでることがあります。

ヒントにもなりませんが。。

僕は受容体をリガンドのアフィニティーカラムを使って膜から抽出して半泣きしました。
うまく行くと、こんなものか～とご飯がおいしく食べられます。

がんばりましょう。

[2] mixiユーザー 01月25日 19:47

丁寧な解説ありがとうございました。
今以上に温度には気をつけてみます。お互い頑張りましょう！

[3] mixiユーザー 02月02日 15:57

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