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自家不和合性コミュのナス科植物の自家不和合性

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ナス科植物の自家不和合性は、配偶体型:gametophytic self-incompatibility(GSI)に属します。すなわち、花粉そのものが花粉側S因子を発現させ、この花粉側S因子によって柱頭との和合性が表現されます。
従って花粉の精核におけるS-specificはS表現型と一致します。アブラナ科植物のように、精核のS-specificとS表現型(SP11/SCRのspecific)とが異なるような事もありませんし、S-haplotypeヘテロの場合は、優劣によらず、2種類のS表現型をもった花粉ができてきます。

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S-RNase:雌蕊でのみ発現、S-locusに座上、RNase活性をもつ、認識ドメインとアクティブドメインとをもつ、認識ドメインはS-specificごとに特異的で超可変領域をもつ、アクティブドメイン(RNase活性)は非特異的。

Figは、S3-RNaseの立体構造です。ヘリックス構造のうち「青」に着色された4つのリージョンが超可変領域、黒で示された部位がアクティブサイト。
ナス科植物の自家不和合性で特徴的に見られる現象は、花粉管の伸長が、途中で止まってしまうという事です。伸長の止まった不和合花粉の花粉管で、rRNAの分解により失活したリボソームが発見された事、S遺伝子型( = 雌蕊側S表現型)S1/S2に対してS3-RNaseを導入した所、S3ホモの個体由来の花粉もrejectされるようになった事(雌蕊側のS表現型がS1/S2からS1/S2/S3に形質転換した)、同様の導入実験でも、RNase不活性型(アクティブサイトのヒスチジン残基をアスパラギン残基に人為的に置換)S-RNaseを導入した場合には、形質転換植物は導入した不活性型S-RNaseと同じS-specificの花粉をRejectするようにはならななかった事から、ナス科植物の自家不和合性は、S-RNaseにより、同一pecificの花粉のrRNAが分解される事によるとして、これを「S-RNase mediated SI」といわれるようになりました。

※後に述べますが、私はこの部分については再検討しなければならないと考えています。
では、この「S-RNase mediated SI」の全体像は、一体どのようなものなのでしょうか? 雌蕊でのみ発現し、S特異的ドメインをもち、RNase活性をもつというS-RNaseの特徴をもとに、それによって花粉(管)のrRNAが分解を受けるというシナリオで、これまでに幾つかのモデルが提唱されてきました。

第一番目は「Gatekeeper model」です。S-RNaseは、雌蕊で発現し、花粉管に取り込まれるのですが、その時、ゲート(チャンネルのようなもの)を通ります。ゲートには、S特異的に通過させたりブロックしたりする性質があり、S-specificの同じS-RNaseだけがこれを通り抜けることができます。花粉管に侵入したS-RNaseは、そのRNase活性によりrRNAや、mRNAを分解し、タンパク質を合成できなくなった花粉は、花粉管を伸長させることができなくなります。

図は、Gatekeeper modelの概念を表したもので、トランスロケーターとあるのがGatekeeper(門番)です。このモデルの特徴は、不和合組み合わせの花粉管にはS-RNaseが存在(侵入)するが、和合組み合わせの花粉管にはS-RNaseが「存在(侵入)しない」ということと、もしもS-RNaseが存在すれば、それによってRNAは必ず分解を受けてしまう、ということです。
第2番目は「Inhibiter model」です。雌蕊由来のS-RNase は、そのS-specificによらず、すべてが花粉管に取り込まれます。花粉管に取り込まれた S-RNase は、花粉側S因子である「Inhibiter」によってS特異的に不活性化されます。すなわちInhibiterは、自らのS-specificと異なるすべてのS-RNaseを不活性化できますが、自らと同じS-specificのS-RNaseだけは不活性化できません。

図は、Inhibiter modelの中でも「Genelal inhibiter model」というもので、S-specificによらずすべてのS-RNaseを不活性化できるinhibiter(Genelal inhibiter)と、これとは独立的にS-RNaseとのバインドをコントロールする花粉側S因子を想定しています。Genelal inhibiterには多型はありません。S特異性の認識は、花粉側S因子とS-RNaseとの間でおこります。花粉側S因子とS-RNaseのS-specificが一致する場合には、S-RNaseに花粉側S因子がくっ付く → S-RNaseにinhibiterがバインドできなくなる → S-RNaseによるRNAの分解 → 花粉管伸長停止、というシナリオになります。
では、この2つのモデルのうち、実際のナス科植物の自家不和合性の特性を、より良く記述しているのはどちらでしょうか? 2000年のNatureに大変インパクトのある論文が発表されました。Immuno gold labellingによってS-RNaseの動態を調べた結果、S-RNaseは、和合/不和合によらず、花粉管の細胞質に局在、蓄積すること、そのS-RNaseは花粉側で発現したものでなく、雌蕊由来であること、和合組合わせ(S-specificが異なる)の花粉管にS-RNaseが侵入しても、その伸長を止められないことが解りました。

この結果は、同一specificのS-RNaseのみを花粉管の中に導き入れるとするGatekeeper modelを否定するもので、異なるspecificのS-RNaseを不活性化するメカニズム(当時は先述のInhibiter modelしかありませんでした)の存在を示唆するものでした。

図は、Doanらの論文(Nature.407.649-651.2000)を元に、私が加筆したものです。S11/S13およびS12/S14の雌蕊にS11,S12,S13およびS14のspecificをもつ花粉を付け、いずれもS11-RNaseをラベルしてその動態を調べたものです。花粉管が花柱の上部1/3程度で伸長を止めているものは不和合、花柱の1/2程度まで伸長しているのが和合組合わせです(何れも受粉16時間後)。TT:誘導組織細胞、Pc:花粉管の細胞質、ECM:花粉管の細胞外基質、BG:バックグラウンドです。グラフの基となった数字は金粒子の数(≒S11-RNase)です。和合/不和合にかかわらず、雌蕊由来のS11-RNaseが、花粉管の細胞外基質に局在する様子をご覧下さい。
DoanらによるGatekeeper modelの明確な否定は衝撃的なものでした。Inhibiter modelよりもGatekeeper modelの方が合理的だと考えられていたからです。

Inhibiter modelでは、S-specificの一致するものだけを不活性化することが「できない」Inhibiterを想定するか、または先述のGenelal inhibiter modelのように、Inhibiterとは別に、S特異性をもっていてS-RNaseとinhibiterとのバインドをコントロールするような花粉側S因子を想定しなければなりません。

ともあれ、Gatekeeper modelが否定されたことから、Inhibiterの探索がはじまりました。花粉側でだけ発現すること、S-RNaseとくっ付いて、これを不活性化すること、S-locus(S遺伝子座)に座上し、S特異性があることなどの条件で絞り込めますので、すぐに見つかるものと思われていました。

ところが、そう簡単には行きませんでした。
F-box遺伝子(SLF/SFB)の発見!

SLF/SFB:S-locus F-box gene 雄蕊側(成熟期のantherとpollen)でのみ発現、S-locusに座上し、S-RNaseの近傍にコードされる、S-haplotypeごとに特異的で、同じS-haplotypeのS-RNaseと相同の領域がある。

1つ目のFigは、PiSLF(Petunia inflata S-locus F-box gene)の発現部位、発現時期、S-specificを示したもの、花粉側S因子として特徴を持っていることがわかる。

2つ目のFigは、PiSLF導入実験の結果を示したもの。異なるspecificのPiSLF導入により、自家不和合性が打破され、種子が得られた。得られた種子のS遺伝子型を調べ、消去法でReject「されなかった」種子のS遺伝子型を推測してPiSLFの「S機能」を調べた。宿主のS-haplotypeとは別のspecificのPiSLFが導入された花粉は、不和合機能を失い和合になってしまう → F-box遺伝子産物は花粉側S因子ではあるが、S-RNaseの「inhibiter」ではない。
2004年、F-box遺伝子産物がUbiquitin/26S Proteasome経路と関連がある事が見い出され、ProteasomeによるS-RNaseのS特異的分解が自家不和合性の表現であることが示唆されました。

SFB/SLFは、SCFコンプレックスのコンポーネントであり、SCFコンプレックスは、ユビキチンシステムにおけるE3(標的タンパク質に共有結合する際のリガーゼ)活性をもちます。S-RNaseはSCFコンプレックスによりS特異的にユビキチン化されます。ユビキチン化された S-RNaseはプロテアソームにより「分解」を受けます。

図は、F-box遺伝子産物によるS特異的ユビキチン化を自家不和合システムの中心的なリアクションとしたモデルです。和合組合わせの場合はS-RNaseはRNase活性を維持しますが、不和合組合わせの場合のS-RNaseは、プロテアソームにより分解されてしまいます。

私はこのモデルを「Ubiquitination model」と呼ぶことにしています。
 Ubiquitination modelのアイデアは、SFB/SLFと同一specificのS-RNaseは選択的に分解され失活するというものです。

 ところがSFB/SLFは同一specificのS-RNaseと相同な領域をもっています。相同の領域を持つ分子は親和性が高いと考える方が自然で、配列の「異なる」ものだけを選択的にユビキチン化するというアイデアは不自然です。

 それに、S-RNaseがプロテアソームによる分解を受けるまでは活性を維持するとすれば、S-RNaseが花粉管に侵入する前に、雌蕊側(ヒトではないけど「自分」)の誘導組織細胞などのRNAが分解されてしまいます。

 また、プロテアソームによる分解は、「ユビキチン」システムの名前の通り、S-RNase mediated SIに限られたものではありません。

 ここで、この研究には新たな知見が必要になりました。
 2006年に新しいアイデアによるモデルが発表されました。S-RNaseは、雌蕊側S因子である他の分子(120KとHT-B)と共に(?)「エンドサイトーシス」により(?)花粉管に取り込まれ、小胞のまま細胞外基質と隔離されたまま液胞に移行します(?)。このうち「一部」のS-RNaseは小胞を出て(?)F-box遺伝子産物と出合って自他認識を行います。自他認識の結果、異なるspecific(他家受粉など)の場合はPPが活性化(?)、HT-Bが分解を受け、雌蕊側S因子の閉じ込められた液胞は維持されます。S-RNaseはRNAに結合(〜分解)することはありません。
 一方、同一specific(自家受粉など)の場合は、雌蕊側S因子の閉じ込められた液胞は崩壊し、S-RNaseがRNAを分解します。

登場人物(分子)は以下の通りです。

HT-B:Small asparagine-rich protein 雌蕊側S因子、S特異性を示さない、成熟雌蕊でのみ発現し、花粉側では発現しない、HT-B欠失株は不和合花粉のRejectに失敗する。

4936-factor:雌蕊側S因子、S特異性を示さない、まだクローニングされていない、雌蕊でのみ発現、4936-factorミュータントは不和合花粉のリジェクトに失敗する。

120K:120k Da glycoprotein(S-RNase binding protein)、雌蕊側S因子、S特異性を示さない、アラビノガラクタンに富む、雌蕊の細胞外基質に存在し伸長中の花粉管に取り込まれる、RNAiにより不和合花粉のリジェクトに失敗する。

PP:hypothetical pollen protein  詳細不明、花粉側S因子(?)、HT-Bを分解する(または失活させる)。

Figは、このS-RNase局在モデルの概念を示したものです。「?」の部分は未知の部分、または他の可能性も否定できない部分です。
 このS-RNase局在(閉じ込め)モデルは、ナス科植物の自家不和合モデルの中では最も新しいものですが、それでもまだ説明の難しい部分がたくさんあります。

 S-RNaseがモノマーの状態でRNase活性を有するなら、雌蕊側のRNA(誘導組織細胞などのRNA)が分解を免れることを説明できない。花粉管に取り込まれたHT-Bが、液胞に局在するのかどうかわからない。液胞の崩壊と、HT-Bの分解/安定化との因果関係が明確でない。液胞の崩壊、S-RNaseによるRNAの分解、花粉管伸長停止の因果関係が明確でない。花粉管に取り込まれたS-RNaseは、液胞に移行する前に、先ず花粉管の「細胞質」に局在する(このトピックの「5」参照)。120K(その名もS-RNase binding protein!)は、定常状態でS-RNaseと複合体を形成すると考えるのが自然。 小胞あるいは液胞にあるタンパク質(S-RNase)の「一部」が、自他認識の目的で、チャンネルや能動輸送系によらず細胞質に移行するとは考えられない。
 ここで一度原点に立ち返って「S-RNase mediated SI」について考えてみた方が良いのかも知れない・・・。本当にS-RNaseによるrRNAの分解がナス科植物の自家不和合性の機序なのか? あるいは、S-RNase mediated SIから一度離れて、別のアプローチも試みる必要があるのではないだろうか?
 私の考えていること・・・

 私は雌蕊側S因子であるS-RNaseにより、雌蕊側の細胞(例えば誘導組織細胞:TTC)のRNAが分解されないことを含めて説明するため、以下のような仮説をもとに「Activator model」を考えてみました。

仮説
・S-RNaseがRNase活性を発揮するためには、Activatorの結合による活性化またはInhibiterが外れることが必要。

・S-RNaseが雌蕊側に存在する時、および和合組合わせの時は、不活性の状態が維持されたままである。

・SCFコンプレックスによるUbiquitination機能は、プロテアソームによるS-RNaseのspecific依存的、選択的分解ではなく、液胞への「局在化」である。

以下に図で概念を示します。
私の考えるモデルは「Activator model」です。アイデアのコアの部分を幾つか書いてみますと・・・。

1.モノマーのS-RNase自体はRNase活性を持たず、Activatorの結合を受けてはじめて活性化される。
2.120k Da glycoprotein(S-RNase binding protein)は、雌蕊側に存在する時、およびS-RNaseのRNase活性が「-」の時、S-RNaseに結合している。すなわち、Inhibiterの候補、またはActivator結合阻害因子の候補である。
3.120k、HT-BおよびS-RNaseの取り込み様式は「エンドサイトーシス」ではなく、先ずは花粉管の細胞質に局在し、ここでSCFコンプレックスと出合う。

図は伸長途中の花粉管における自家不和合初期反応の模式図です。S-RNase-120KコンプレックスおよびHT-Bが花粉管に取り込まれ、SLFによる分子認識およびSCFコンプレックス(SLFが主な構成要素)によるUbiquitinationを経て液胞に移行する所までを示しました。ここでは120KをS-RNase inhibiterまたはS-RNase activator結合阻害因子の候補として、HT-BをS-RNase activatorの候補として記述しましたが、それぞれ他の分子が存在する可能性もあります。
自他認識の結果、S-RNase-120KコンプレックスがSCFコンプレックスと同一specificであるならば、HT-B(S-RNase activatorの候補)が選択的に分解を受け、S-RNase-120Kコンプレックスの液胞への局在は維持されます。

図は、HT-Bが選択的に分解された様子を示したものです。この場合は「和合」の組合わせとして、花粉管は伸長を継続します。
自他認識の結果、S-RNase-120KコンプレックスがSCFコンプレックスと異なるspecificである場合は、HT-B(S-RNase activatorの候補)は安定、液胞膜は崩壊し、120Kは液胞の崩壊と共にS-RNaseから外れます。

図は、液胞が崩壊し、120KがS-RNaseから外れた不和合反応初期の様子を示したものです。
不和合組合わせと認識された花粉管では、液胞の崩壊と共に120Kが外れ、S-RNaseが遊離状態になっています。今度はこのS-RNaseにActivatorが結合し、ついに活性型S-RNaseとなり、RNAを分解してしまいます。

図は、S-RNaseにActivatorが結合し、活性型S-RNaseとなった不和合反応「後期」の様子を示したものです。
・・・と、ここまでの仮説は、これまでの「S-RNase mediated SI」すなわち、S-RNaseによるRNAの分解を自家不和合反応としたものですが、この他に「液胞の崩壊」を自家不和合反応とした仮説も考えられます。

この場合はナス科植物の自家不和合性については、原点すなわち「S-RNase mediated SI」まで立ち返って考えてみる必要があります。
バラ科植物で、X線照射によって得られた人為突然変異体の中から、花粉側S因子(・・・の一つとされる)のSLF/SFBを欠失または不活性型SLF/SFBをもつ個体がスクリーニングされ、これを用いた交雑実験が行われました。

結果、SLF/SFBは自家不和合性(S-RNase mediated SI) に必須であることがわかりました。これまで、人為合性複ニ倍体を用いた交雑実験や、SLF/SFB遺伝子導入実験の結果から、自家不和合性の打破に必要なのは、1つのhaplotypeの中にヘテロのSLF/SFBが同時に存在すること、または人為合性複ニ倍体から花粉ができてくる際に、相同組換えの結果、花粉側の S-locus がヘテロであること、と言われていました。

SLF/SFBをノックアウトしても自家不和合性が打破できることが示され、「Ubiquitination model」のアイデアは否定されることとなりました。Ubiquitination modelのアイデアに従うと、SLF/SFB無しには、S-RNaseの選択的ユビキチネーションが起こらず、この場合は、S-specificによらずS-RNaseは活性を示し、すべての個体について自家不和合性を示すこととなるはずだからです。バラ科植物の自家不和合性もナス科植物のそれと同じく S-RNase mediated SI です。

図は Ubiquitination model の概念を示したものです。(このトピックの項目「10」をご覧下さい)
このトピックの第10レスの記述に誤りを発見いたしました。以下の記述に訂正いたします。大変申し訳ございませんでした。

図のアイデアについて説明した記述・・・

図は、F-box遺伝子産物による S特異的ユビキチン化を自家不和合システムの中心的なリアクションとしたモデルです。不和合組合わせ(雌蕊の S-specific と花粉の S-specific とが一致)の場合、S-RNase はユビキチン化されず、その RNase 活性を維持し、これにより花粉管の RNA が分解されてしまいますが。和合組合わせ(雌蕊の S-specific と花粉の S-specific とが異なる)の場合は S-RNase は、ユビキチン化されてプロテアソームにより分解を受けます。恐ろしい S-RNase がいなくなった花粉管は、活性を保つのに必要なタンパク質を合成できるので、花粉管伸長を継続できます。

私はこのモデルを「Ubiquitination model」と呼ぶことにしています。
このトピックの第5レスの記述に誤りを発見いたしました。以下の記述に訂正いたします。大変申し訳ございませんでした。

和合/不和合にかかわらず、雌蕊由来のS11-RNaseが、Pc:花粉管の細胞質に局在する様子をご覧下さい。

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