ミクロトーム！！コミュの凍結切片の作成に関して

２年ほど前に作られた凍結ブロックをクライオスタットを使って今切っているのですが、ひび割れや組織部分だけくるりんとまるまってしまってうまく切れません。
２年前のサンプルだからというわけではたぶんないだろうと思いますが、
最近作った凍結ブロックを切った場合ではそのようにはなりません。
何かよい解決方法はありませんか？
固定：4%　PFA
脱水：10%スクロース⇒20%スクロース⇒30%スクロース
包埋：OCT Compound（綴り間違えてるかもです）
セクションの厚さ：20μmくらい
サンプル：mouse embryo（E10~11）

コメント(6)

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[1] mixiユーザー 09月09日 19:00

凍結して長期間保存していると、乾燥してそういう状態になります。
もし何かいい方法があったら僕も知りたいですのでどなたか教えてください。

新しいblockでもそうなるならば、なじませ方が甘い事が多いです。OCTの中で、ゆらゆら～ゆらゆら～と３０分くらい十分なじませてから凍結するとだいぶん違います。
参考までに。

[2] mixiユーザー 09月10日 07:16

wattyさんのおっしゃるように組織の乾燥が原因と思われます。
長期凍結保存しておくと、どうしても水分が昇華して乾燥してしまいます。ですから、通常はOCTコンパウンドで薄切面をカバーした上に、パラフィルムとアルミホイルで包んで乾燥を防止しますが、embryoですと、組織の対してコンパウンドの体積がかなり大きくなりますので、乾燥を防ぐにも限界があるでしょう。経験的に２年は厳しいかな。

乾燥してしまった凍結組織を復活させる方法は、わたしも知りたいですね。今のところどうしようもないという認識です。

ちなみに、スクロースの勾配をくぐらせるのを”脱水”としていますが、ちょっと違うかなあ。

[3] mixiユーザー 09月10日 09:38

wattyさん、ふみさん
早速ご意見ありがとうございます＞＜
やはり乾燥の要因が一番高いかもですね・・・
私が今回切ったブロックは先輩から受け継いだものなのですが、先輩はブロックを－80℃耐性のプラスチック容器にそのまま入れて、容器の隙間をビニールテープでぐるっと巻いて、それをチャック付のビニールテープに入れ、－80℃に保管していたようです。
個々にアルミホイル等で包んで、かつ二重三重にしたほうがいいんでしょうか・・
というか２年前って・・・サンプル作り直せよって感じですが・・OTL

ふみさん
正しくはスクロースへの置換という表現をするべきでした；
30%スクロースにも70%は水分ですね・・・；ｗ

[4] mixiユーザー 09月10日 12:28

＞ふみさん

やはりどうしようもないですか・・。私はスクロースの中で４℃で保存していますが、1年くらいならだいたいの抗原は染まるのではないかという印象を持っています。

Sthenoさんのサンプルがもし本当に貴重なものならば、いっその事パラフィンにかえてみるというのは無茶なんでしょうか？やった事ないし、自分ではやりたくないですが・・。

[5] mixiユーザー 09月11日 07:24

わたしは直接パラフィルムを巻いて、その上からアルミホイル、さらにパラフィルム、アルミ、と２重巻きしてます。－80℃耐性のプラスチック容器って、凍結包埋皿のことだと思うのですが、あれにいれっぱなしのやつはけっこう切りにくいので、よくないかもですね。
embryoだと、さきに書いたとおり、組織に対してコンパウンドの体積が大きいので、なるべくコンパウンドをトリミングしたいところですが、かといって切り詰めすぎると扱いずらくなるしやっかいですね。

embryoは、扱いたくない検体の筆頭です^^;)

スクロース中で４℃で保存、というのは考えたこともありませんでした。乾燥を防ぐ観点からは、たしかによさげ。スクロースの長期保存って、すぐにカビそうと思ってましたが、容器と環境がちゃんとしてれば意外に腐らないですしね。考えてみれば、要するにシロップ漬けですもんね。凍結・融解による影響が問題ないものなら、使えそうです。

[6] mixiユーザー 09月11日 09:52

wattyさん
　スクロース漬けはよくやります（ｺﾗ
　ただ、長期間保存しっぱなしだと、ちょこっと組織が縮こまって変形してしまう（らしい）ことがある（らしい）です。（実験自体には支障はないらしいです）

ふみさん
　－80℃耐性のプラスチック容器は、ほんとに・・ふつうに・・蓋と箱があって、その中に入れてありました。もともとはたぶんｴｯﾍﾟﾝﾁｭｰﾌﾞを立てて保存する容器を改良してありました；

サンプルがｶﾋﾞたら・・いやですね・・・；

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