PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）コミュのPCRの反応液の保存期限

二つの意味で伺いたいのですが、

まず今日PCRをかけようと反応液を調製いたしましたが、機械の利用に予約制がなく丁度2、30分前から別の研究室の方がいつも使っているサーマルサイクラーを使用していたので、他の機械で掛けて増幅の条件が変わるのも嫌だったので1時間半4℃保存してからサーマルサイクラーにかけました。

単純に考えると温度が上がっていないので反応はほとんど進んでいないと思いたいのですが、どう思いますか？

それから、一般的にPCRで増幅した反応液はどれぐらい保存可能でしょうか？(電気泳動の結果の信頼性が落ちない期間)
研究室では4℃下で1週間、長くてぎりぎり2週間と聞きましたが、ご意見をお願いいたします。

コメント(6)

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[2] mixiユーザー 12月21日 19:46

だいぶ日数が経ってしまってるのですいません。経験者の意見です。

>1時間半4℃保存してからサーマルサイクラーにかけました。

温度を上げたり下げたりしない限り反応は進みません。なので反応の進みに関しては大丈夫ですが、酵素が失活することが心配です。
自分の経験上、Taqでしたら結構強いので大丈夫です。

>PCRで増幅した反応液

これは2週間ぐらいになるとバンドがスメアになってきますので、2週間は本当に限界です。
出来ればPCR後はすみやかに使ってください。
もしどうしても保存したい場合には、DNAの精製キットを使い、ポリメラーゼを除去することが出来れば、凍らせて長期間(半年が限度かな?)保存可能です。

[3] mixiユーザー 01月05日 17:21

返信ありがとうございました。
気づくのが遅れてしまい申し訳ありません。

お二人とも言われていた酵素については、ケイさんのおっしゃったようにTaqを使っています。
この時の反応で得たデータをどうするか迷っていたのですが、各遺伝子の数値も別のPCR反応の時のものと大きな差はありませんし、温度の観点からも問題なさそうなので、使うことにいたします。

PCR反応液の保存期間についても、ギリギリが二週間ということで改めて確認できました、ありがとうございます。
時間が経つとスメアになってしまうのですね。ポリメラーゼを除去すればということは、放置している間に違う鎖が合成されてしまうのでしょうか。

いずれにしろGoodJobさんのおっしゃるように、できるかぎり直ぐに電気泳動してしまおうと思います。一度目の泳動でバンドの発現が上手くいかなかったサンプルについて、泳動のやり直しをいつまでにすればいいかと考えていたのですが、一週間以内には行った方がよさそうですね。
とても勉強になります、ありがとうございました。

[4] mixiユーザー 01月14日 19:45

>ポリメラーゼを除去すればということは、放置している間に違う鎖が合成されてしまうのでしょうか。

いえ違います。DNA合成に関与する酵素は、同時にDNAを3'→5'方向に分解する働きを持っています。
合成とは逆の力も同時に持っているんです。(校正機構などと呼ばれます。)だからしばらくおいておくと分解の力でどんどん分解していってしまうんです。

知識がかなり必要になるのが遺伝の研究です。これからも頑張ってください。
またわからないことがありましたらどうぞ。

[5] mixiユーザー 01月20日 13:17

あれ、　Taqってプルーフリーディングでしたっけ？

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