【生体膜分子のダイナミクス】コミュの【質問】Triton X-100可溶タンパク質？

ものすごーくつまらない質問かもしれませんが、未熟者なので誰か教えてください！！

論文を読んでいたら、膜レセプタータンパク質(HER2)がTriton X-100不溶画分で発現が評価されていました。
Triton X-100は界面活性剤なので、可溶画分で評価すべきなのでは？と疑問を持っています。
参考書等を読んでも、可溶化すると書いてあるし・・・

誰か、理由の分かる方教えてください。

また、このような現象は、レゼプタータンパク質において一般的であるのか、それともHER2限定的であるのかも分かる方がいらっしゃいましたらよろしくお願いします。

コメント(6)

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[1] mixiユーザー 10月09日 19:12

リエコさま、はじめまして。

HER2については全く存じないのですが、HER2はサブユニットを持ちますか？　Triton X-100の代わりにSDSを用いて溶解し、両者を比較した評価はされていますか？　お読みになった論文はHER2の何を評価しようとしたものですか？（アミノ酸一次配列、分子量など）

[2] mixiユーザー 10月09日 19:47

リエコ様

Triton不溶性画分ということでしたら、HERはラフトに局在する蛋白質ではないでしょうか。ラフトはコレステロールリッチな膜フラクションですので、TritonX-100には不溶性です。論文に細胞をTritonX-100で可溶化したのち、超遠心チューブの底にサンプルを入れて、浮いてくる画分をとる云々と書いていればラフトの一般的調製法です。

ラフトについてはこちらをどうぞ
↓
http://ja.wikipedia.org/wiki/脂質ラフト

[4] mixiユーザー 10月12日 01:39

りえこさん

はじめまして。
Triton X-100不溶画分で発現が評価されていたのは、こうのさんがおっしゃっているように、注目するタンパク質がraftに存在するかどうかを評価したかったからではないでしょうか？

raftは、古くから界面活性剤不溶の低密度画分（DRM:detergent resident membrane）と定義されてきました。
こうのさんがおっしゃっているようなショ糖密度勾配遠心法などを用いて、
目的のタンパク質や脂質がDRMの画分に入るかどうかで、それらがraftに存在するかどうかを評価している報告はたくさんあります。

ただ、ショ糖密度勾配遠心法は、面倒くさいので、より簡単な方法で、raftに入るかどうか（正確にはDRMに入るかどうか）を評価している論文が、近年多くなってきています（例えば、Kenworthy et al. 2004, JCB ; http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2172371)

すなわち、細胞を1%TritonX-100で15 min (on ice)で処理して細胞膜にprobeが残っているかどうかを評価するといった方法です。

例えば、GFPを融合させたレセプタータンパク質を細胞に発現させ、そして上記の条件で処理します。蛍光probeが膜に残っていたならDRM分子、溶け出しているならDRM分子ではない、すなわち、raftに入る分子ではなさそうだということになります。

Kenworthy et al. 2004のfigure.2にあるように、LATやFynなどはTriton不溶であると報告されています。私もGPIアンカータンパク質については、実験して同様の結果を得ることが出来ました。

「レゼプタータンパク質において一般的であるのか」とありますが、詳細はまだわからないと思います。というのも、raftそのものが生きている細胞の細胞膜に存在するかどうかもまだわかっていない仮説の段階ですから。

ただ、『TCR、BCR、synapse、細胞接着などに関わるいくつかのreceptorタンパクが界面活性剤不溶だ』という報告は多くなっているようです。ですから、界面活性剤不溶であるreceptorタンパク質は他にもあり、HER2限定的ではないと思います。

余談です。界面活性剤にはCHAPSなどいろいろありますが、種類によってprobeの抜けやすさが異なるという論文が、2008年か07年のBiophysical journalにあったような。だからいろいろ注意するべき点は多いようです。

[5] mixiユーザー 10月12日 08:30

＞とみちゃんさん
論文はタンパク質発現をウエスタンを使って見ているだけです。
SDS単独での評価はされていないようですが、不溶画分を溶かすためにSDS loading bufferで95℃15分加熱したそうです。

＞詳しい実験方法が書かれていませんでした。
triton X-100不溶画分はSDSで溶かす以外の詳しい説明は論文ではされていませんでした。

＞とみちゃんさん、こうのさん、たなっちさん
親切で分かりやすいお返事ありがとうございます。

勉強不足なようで、ラフトの存在自体知りませんでした(>-<)
おかげ様で、何をヒントに勉強すればいいかが分かったような気がします。
ラフトを勉強して今後に活かしていきたいと思います。

ありがとうございました。

[6] mixiユーザー 10月21日 02:12

>リエコさま
どうも初めましてCait Sithと申します。
界面活性剤にも「陰イオン性」「陽イオン性」「両イオン性」「非イオン性」のものがあります。細胞膜表面のタンパク質は様々なものがありますが、Triton-X100で溶けるものがあればNP-40において溶解するタンパクも居たりします。脂質性ラフトに局在している場合はSDSなどは陰イオン性の界面活性剤(SDSなど)を使用した方がいいでしょう。目的にもよりますが、検出のみの場合は手っ取り早く2-mercaptoethanolなどでタンパク質の立体構造を破壊されてはいかがでしょうか？また精製・単離、立体構造を保持させたい場合は酵母などのを使用した大量精製系における単離・精製をお薦めします。細胞における強制発現系においては、細胞内におけるそのタンパク質の動向、性質を調べることはできますが、そこから単離・精製を行っていくのはコストと実験量が大変多くなり困難です。
万が一、細胞からの単離を試みる場合はRIPA bufferを使用し溶解させてみて下さい。脂質性ラフトに局在するタンパクをこれにて単離できことがあります。
<RIPA buffer>
50 mM Tris, pH 8.0
150 mM NaCl
0.5mM EDTA
1 mM DTT
1 % NP-40
0.5 % Sodium Deoxycholate
0.1 % SDS
100μg/mL PMSF*
1μg/mL Aprotinin*
2μg/mL Leupeptin*
100μM Sodium Vanadate

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