機器分析コミュの質問です。HPLC ﾋﾞｰｸ保持時間について

汎用ODSｶﾗﾑで、あるﾎﾙﾓﾝを測定しているのですが、ﾘﾃﾝｼｮﾝﾀｲﾑが徐々に早まります。

ｶﾗﾑは新品、移動相は水/ｱｾﾆﾄ/ﾘﾝ酸混合液です。

何度も測定するとズレの間隔は小さく(0.2min⇒0.05minくらいに)なりましたが、ｱｾﾆﾄで洗浄すると、またﾘﾃﾝｼｮﾝが遅れてから、徐々に早まってきました。

移動相･ｻﾝﾌﾟﾙ共に酸性、
ｶﾗﾑは合計40時間程度（洗浄含む）使用しています。

ｼﾗﾉｰﾙ基の解離･非解離が原因なんでしょうか？

思い当たる原因、対処法など教えて頂きたいです。
よろしくお願いします。

コメント(8)

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[1] mixiユーザー 02月27日 00:10

ホルモンの分析の経験はありませんが、HPLCは普段の業務で使用してます。。。

測定前のカラムの平衡化は充分に行われてますか？
カラムや酸濃度などによりますが、私はカラムの平衡化に一晩以上かけることもあります。
グラディエントをかけている系なら必ず1度分析前にブランクでグラディエントをかけるようにしてます。

最終置換溶媒はアセニト100%なのでしょうか？
私はカラムの添付文書を見て出荷時の置換溶媒に近づけるようにしています。
また、アセニト洗浄の前には水系でも洗浄しているのでしょうか？

まぁ、超高速HPLCでない限りは0.2minくらいのRTの変化はあまり気にしませんけどね。

[2] mixiユーザー 02月27日 00:56

アイソクラティックで連続分析中にRTがどんどん早まってきたら問題でしょうけど・・・

カラム洗浄後、移動相に切り替えて平衡化が不十分だとずれるでしょうし、
毎回同じように移動相作っていても微妙に比率が違ったりすることもあるので、
日間のRTずれは気にしなくても。

なお、洗浄は今回のケースでは（水＋リン酸）／（アセニト）混液で酸を十分に洗ってからアセニト
（もしくは出荷時の溶媒）に置換しないと、カラムの劣化が早まりますのでご注意を。

[3] mixiユーザー 02月27日 22:13

> maikoさん

アドバイスありがとうございます。

洗浄は、移動相からﾘﾝ酸を抜いた組成液で洗浄後に、ｱｾﾆﾄ100％で洗浄してます。
移動相に変更する前にもﾘﾝ酸抜きの液を挟んでます。

新品ｶﾗﾑだったので平衡化不足かと思い、一晩低流速で移動相を流してみて...確かに改善はみられたのですが、洗浄後に戻ってしまったので原因ではないと思っていました。
でも、毎回そのくらいの平衡化が必要なのかもしれませんね

試してみます！

ありがとうございました

[4] mixiユーザー 02月27日 22:44

> エビさん

アドバイスありがとうございます。

残念ながらIso分析なんです。連続分析するとどんどん早まってしまって。。。

また、だいぶ安定してきた気がしたので、試しに一度洗浄を挟んで(同じ移動相で)分析すると、洗浄前 19.9min⇒洗浄後 20.8minになってしまいました。そしてまた徐々に早まってくるという状況です

平衡化不足が怪しいので、十分に時間をとってみます。
ありがとうございました

あと、教えて頂いた洗浄方法について質問なのですが、（水＋リン酸）／（アセニト）混液というのは、（水＋リン酸）とｱｾﾆﾄを分けて作製し、比率を変えながら洗浄した方がいいという意味なのでしょうか？

知識不足で申し訳ないです

よろしくお願いします。

[5] mixiユーザー 02月27日 23:05

たぶん十分に平衡化すれば、20min前後で安定したRTになると思いますよ。

NH2カラムでは、RTが1min単位で早まってもそれが正常ということもありますから(^◇^;)

あ、洗浄方法は３で書かれた方法で正しいです。
同じ意味で書いたつもりでしたが、逆にわかりにくくなってしまったようで、失礼しました<(_ _)>

[6] mixiユーザー 02月27日 23:37

> エビさん

回答ありがとうございます。

カラムによってはそんなにズレる事もあるんですね！？知らなかったです

洗浄方法についても、もう一度いろいろ考える良いキッカケになりました。もっと勉強します

ありがとうございました

[7] mixiユーザー 03月18日 02:21

だいぶ遅くなりましたが、問題は改善されましたか？
イソクラ分析の際、データ取りの後に洗浄メソッドを毎回挿入すれば、改まってカラム洗浄の手間は要りませんよ。

グラジエント分析が可能なシステムであれば、分析データ収集後、アセトニトリル濃度を添加している塩などが析出しない程度まで上げて、数分保持し洗浄すれば大丈夫だと思います。
例えば、
0min アセトニトリル10％
20min アセトニトリル10％
25minアセトニトリル80％
30minアセトニトリル80％
32minアセトニトリル10％
37minアセトニトリル10％
のようなグラジエントで、前半の20分程度で分析、後半で洗浄というメソッドで保持時間の維持が出来ると思います。

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