透過型電子顕微鏡友の会コミュの免疫電顕初心者です

はじめまして。
こちらのコミュニティの情報量に圧倒され、参考にさせていただいています。

近々、免疫電顕を始めることになりました。培養細胞に作用させたあるタンパクの挙動(局在等)を、
電顕レベルで観る、というものです。
普段はQuetol812やPoly/Bed812を愛用していますが、免疫電顕用にとLR White (medium)を
購入してみたところ、なかなか思うように重合しません。
まだ細胞を材料にして試す段階ではなく、培養用のディッシュにただ樹脂だけを入れて硬化させてみる、という段階です。
(本番の細胞では、固定もオスミウムフリーにする必要があるので、まだまだ条件検討が必要です)

「酸素に触れないようにできれば真空で、抗体のアクセスのために50℃で重合」との記載を
「よくわかる電子顕微鏡技術」(朝倉書店)やその他の電顕関連テキストに見つけ、
何度かその通りにしてみましたが、樹脂は収縮するし、重合後は白く不透明になるし…
(だからLR「white」なのでしょうか？)

「加速剤を入れて4℃で重合」というのも試してみましたが、こちらは透明ではあるもののやはり収縮が大きく、またあまりちゃんと硬化しませんでした。

エポキシ系樹脂では経験のない失敗ばかりで、何か間違ったことをしているのではないかと不安です。
LR whiteのご経験のある方がいらっしゃいましたら、アドバイス頂けたら嬉しいです。
あるいは、別のお勧めの手法がありましたら、教えてください。
(Lowicryl K4Mも候補ではありましたが、低温で紫外線重合させる場所がないため、今は保留です…)

どうぞよろしくお願いいたします。

コメント(8)

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[1] mixiユーザー 06月24日 01:14

LR White(Hard)使ってます。
研究室の慣例通りにやっていたので、真空とか50度とかほぼ初耳で、勉強になりました。
新しいものを使う時って、大変ですよね…

さて、私はLR Whiteを使うときは、ゼラチンカプセルに試料を包埋し、カプセル台ごとビニル袋に入れ窒素で充填し、加速剤なしで65度で重合させてます。

多少の収縮はありますが、白くなったことはありません。

真空の方が収縮を防ぐことができそうな気もしますが、どうなんでしょう。

ほかの樹脂ですが、きちんと硬化しなかったものを、重合温度を上げたら硬化した、ということもありました。

他にもアドバイス聞いてみたいですね。

[2] mixiユーザー 06月24日 02:33

＞ゆっけさん
さっそくのコメント嬉しいです！
やはり、白くなるのはなにかおかしいのでしょうね；

付着系の細胞をディッシュの底に培養して、ディッシュのまま固定～包埋して糸鋸で切り出しています。
エポンだとこれでいいのですが、LR whiteは酸素を嫌うそうなので、細胞を培養したディッシュかカバーグラスに、樹脂を満たしたゼラチンカプセルをぴったり乗せて重合、という手もトライ中です。(が、まだ上手くいってません…)

「酸素を嫌うので出来れば真空で」という手法だと、バキュームオーブンの中でどんどん揮発して液量が減っていくし、白くなってくるし、出来上がった樹脂は縮んでしまって(涙)。

ゆっけさんの方法にならって、まずはカプセルに樹脂を密封して温度を上げてやってみます。
付着系の細胞ではなく、浮遊系ならビームカプセルでいけそうです。
ラボの設えで窒素充填できるるかどうかも検討してみます。できそうだったら、ディッシュのまま窒素充填すれば、ゆっけさんのように上手くいきそうですね。

少し希望がわいてきました。ありがとうございました。早速明日試してみます。

ちなみに、脱水からLR whiteに置換していくとき(エタノールとの混合段階)は、空気中でも構わないのでしょうか？

[3] mixiユーザー 06月24日 06:12

> みわ＠MVX250Fさん
なるほど、どんどん揮発してしまうのですね。涙ものですね。
付着系の細胞というのもなかなか扱いが難しそうですね。
知識がないのですが、密閉できるような小さめのカプセルのような入れ物で培養できたら、簡単に包埋、重合できそうな気が。
(固定でそういう発想の話を聞いたことがあります)

脱水、置換では空気のこと全く気にせず、ほかの樹脂と同じようにやってます。

うまくいきますように！

[4] mixiユーザー 06月24日 15:59

最近、LR-Whiteを使っていませんが、幾つか試したことを書きます。

確か、LRはスチロールを溶かしてしまったような気がします。白くなっているのはそのせいではないでしょうか。よって、培養にスチロールディッシュを用いて、エポン樹脂のようにディッシュをそのまま包埋板の様には使えなかったと記憶しております。
培養細胞を用いる際には、アクラフィルムと言うものを用いて行うと良いと思います。

LRの包埋に関して、酸素が重合不良を起すので、嫌気性菌の培養セットを利用すると言う方法もありますし、空気と触れ合う場所をラップ等で覆う方法も有効です。
出来るだけ、密封することで樹脂の揮発と酸素の影響は防げます。
ジップロックに酸素吸着剤を入れて、その中に包埋板を入れて硬化させたこともあります。

重合温度も免疫電顕の場合50度となっておりますが、私も50度では巧く重合した記憶がありません。知り合いでもそのようなことは申しており、重合装置の庫内温度を55度から60度ぐらいに設置すると良いようです。
一度試しにゼラチンカプセルに樹脂を入れて、自施設の装置で出来るだけ低い温度で固まる設定を出されるのがよろしいかと存じます。

また、今回の実験において、postでなければいけないのでしょうか？　preで、金コロイドを用いる方法もありかと思いますが、どんなんでしょうか？

[5] mixiユーザー 06月24日 22:23

ありがとうございます。今日、いくつかの条件でLR whiteの硬化を試しているところです。
空気に触れるのも短時間ならどうかと、加速剤いれて４℃も再再々チャレンジしています。
付属のレシピには「10mlに対し１ドロップ」とありますが、配合が微妙なのかなかなか上手くいきません。。。
加速しすぎてすごい熱とともにあっという間に固まっちゃったり、1時間以内で固まる予定がゲル状のままだったり･･･やはり熱重合がポピュラーなのでしょうか。

＞ゆっけさん
窒素ガスを使う手立てがラボに無かったので、とりあえずはビームカプセルに密封したり、カプセルをカバーガラスで塞いでみたり、ディッシュをパラフィルムで封じたりして、６０℃加熱中です。明日までどきどきです。。。

小さい入れ物の中での培養、というのも手ですね。
しかしながら、ブツを取り込んで変化が出た細胞を狙う必要があるので、できれば3cm程度の広さから探し出すことになりそうです･･
小さなカバーグラス等を敷いたディッシュで培養して、該当細胞が載っているカバーグラスをビームカプセルのフタに入れて、樹脂を満たしたカプセルを逆立ちさせて重合、というのが、ゆっけさんご提案のアイディアに近い作戦でしょうか。
ちなみに、カプセルにカバーグラスで蓋をして硬化させる方法だと、樹脂が縮んで隙間ができてしまってダメでした(涙)

脱水・置換は空気中でよいとのこと、安心しました。なかなかそういうことって参考書類には見つからないんです･･･周りにTEMやってる先生もおらず、こちらの皆様の書き込みが本当にありがたいです(TT)

＞kaz-Yさん
なるほど、白くなっていたあれはスチロールがやられてたんですね･･･いつまで経っても固まらない上に
なんだかディッシュもやわらかくなっていたので、そんな予感がありましたorz
アクラフィルム、ずいぶん前に師匠から頂いたものがあり、試そうと思っていたところでした。
ディッシュに敷いて培養して、樹脂置換以後はアクラフィルムごとシリコンなどの容器に移してみます。

嫌気的にするのに、真空オーブンだと乾燥がネックでしたが、
ジップロックに酸素吸着剤ならお手軽に導入できそうです。
いい方法を教えていただきありがとうございました♪

50℃じゃ硬化しないとのこと･･･そうだったんですか･･･；
現在、ビームカプセルで60℃を試しているところなので、これで固まったら少しずつ温度を下げてみますね。オーブンの癖もあるかもしれません。

postかpreか、実は抗体がどれくらいクロスしてくれるかが問題で(光顕でもかなり微妙らしいです)、
最悪の場合は両方やることになると思います。
それと、実は私の仕事というのが、研究所のTEMオペレータみたいなもので、
この先どんな検体や抗体が持ち込まれても対応するために、preだけではなくpostもできるようになっておかなきゃ、という･･･(大汗)
preだけでいけそうなら、エポンでOKなんですけどね(^^；

[6] mixiユーザー 06月25日 11:03

アクラフィルムには、ハット法と言って、アクラフィルム自身を培養ディッシュにすることが可能です。

日新EMのカタログにたぶん参考文献が出ておりますので、ご確認下さい。

それと、加速剤での重合もかなりシビアと聞いております。
１０ｍｌに対して１ドロップと書いてありますが、発熱等を抑えたりするには、数μlで計らないと駄目なようです。
私は、条件出す前に諦めました。（重合熱が尋常じゃなかったのもその理由）

光顕で微妙なもののpostは、難しそうですね。
結果も慎重にならないと駄目でしょうね。

最近、電顕をする方が少なくなっているので、頑張ってください。

[7] mixiユーザー 06月25日 12:30

ちょうど同じようにLR Whiteで苦しんでいる者です。
重合についてですが、販売元の応研商事に問い合わせたら、
日本のような高温多湿地域（特に今時期）は50℃ではなく60℃で十合推奨しているそうです。
また、『酸素はできるだけ入れないように』といっていますが、
全体容積の5%までなら十分重合するとのことでした。
ためしにビームカプセルで60℃、液量を9割程度にしても重合しました。

免疫電顕においてLR Whiteは-25℃で紫外線重合する（加速剤添加）のが一番いいみたいですが、装置的な問題がありますね。

[8] mixiユーザー 06月26日 00:07

こんばんわ、トピ主です。
昨日から６０℃オーブンに掛けていたカプセルは、透明に硬化していました！
ゆっけさん、kaz-Yさん、ありがとうございます♪

ただ、やっぱりビームカプセルだと、密閉性に欠けるのでしょうか、空気が出入したのか、
硬化した樹脂の周りが、未重合の液体で濡れた状態になっていました。
また、少し入った気泡に触れていた部分は、効果せずにゲル状になっていました…
加速剤を入れて４℃に入れてあったものも、ビームカプセルは同じような結果でした。
でも、「カプセル密封＋真空などの酸素除去」なら、このトラブルも乗り切れそうな気がしてきました。

ちなみに、加速剤入り/４℃の、パラフィルムで封じたディッシュは全然固まっていませんでした。
カプセルをディッシュに倒立させたものも、ダメでした。
やはり、ディッシュに触れている部分が溶けて、悪さするようですね。。。

＞kaz-Yさん
ありがとうございます。ちょうどカタログ見ているところです♪
アクラフィルムに培養するときに「熱に弱そうだから、滅菌が問題」と培養担当の方に言われましたが、
アルコール滅菌やクリーンベンチのUVぐらいで…と漠然と思っていたのはマチガイなんでしょうか；

加速剤はあまり上手くいかないのか、「熱重合が一般的」という記載が「よくわかる電子顕微鏡技術」にありました。
「30mlに対して8ul」という配合がBioTechnicalフォーラムにありましたが、当方では重合しませんでした。
試しに、「加速剤１ドロップ」をピペットマンで吸ってみると10ulちょいありましたので、
少し加速剤の比率を増やして、5mlに対して5ulにしてみましたが、ゲル状どまりでした。。。
加速剤を増やしていくと、どこからか急に重合する比率があるように思いますが、あまり再現性なさそうにも思えて頓挫中です。

まずは光顕レベルでも見れるという金コロを分けてもらえたので、これで染めてみて検討します。。。
まずはラミンやミトコンドリアあたりをラベルする抗体で練習しておきたいところですが；
今の研究所でも「電顕は壁が高くて手が出せなかった」というお声が耳に入ります。
「そんな中、TEM屋さんが来てくれて助かる」と言っていただけるのが嬉しいです。
お役に立てるよう、頑張ります。

＞しげさん
この時期、特に樹脂には厳しいですね…とはいえ、「雨が降ったらお仕事おやすみ」という訳にはいかないし…；
60℃でも失活しない抗原なら問題ないのでしょうけれど、出来れば少しでも温度下げたいところで、
50℃でなんとかならないものかと思っておりましたが、固まらないことには話にならないですものね；
空気が少し入っても重合したとのこと、おめでとうございます(^^)
こちらは気泡が入っても一応重合はしましたが、湿度の問題なのか空気に触れた部分だけがゆるいままでした。
でも、それまでは重合もままならなかったので、今日は大きな進歩です♪
まだ課題はありますが、希望の光が見えました。アドバイス頂いた皆様に感謝です。

冷凍庫に入れられる紫外線重合装置が結構安価で作れるらしいですが、ラボが狭くてフリーザーもぎゅうぎゅう詰めなので、望むことができません。。（涙）
お互い頑張りましょう！

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