染色こみゅコミュのｱｾﾁﾙｺﾘﾝｴｽﾃﾗｰｾﾞ染色について教えてください

Hirschsprung病の乳児の診断に必要だと言うことで(迅速に使いたい)染め始めたのですが…
染まらないんです!!!

試薬は武藤さんとこで用意してもらった

acetylthiocholine　iodide　　　　10g
0.1Ｍﾏﾚｲﾝ酸ﾊﾞｯﾌｧｰ(6.0)　　　　　　　26ml
0.1Ｍクエン酸Na　　　　　　　　　　　2ml
0.03Ｍ硫酸銅　　　　　　　　　　　　　4ml
蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　4ml
0.05Ｍフェロシアン化Ｋ　　　　　　　　2ml

で２～48時間となっているのですが、24時間たっても染まってるのかないのかわからない色で…
凍結切片を使用しているのでそこに問題があるのかと考えましたがさっぱりわかりません

どなたか経験があるかた意見をきかせてください〆(･Å･`o)ﾉ

ＭＢＬでのキットもあるとのことで検討していますが
こちらも経験アル方、意見をきかせてください！

まだ１年目のﾋﾟﾖﾋﾟﾖです。
頑張って染めてみたいのです(;￫㉨￩)

コメント(4)

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[1] mixiユーザー 06月01日 21:01

アセチルコリン染色ですね。当院でも行っていますので参考になれば。
標本は凍結を用います。pH7.4　10%ホルマリンカルシウムで数秒固定します。試薬の調整ですが、ヨウ化ｱｾﾁﾙﾁｵｺﾘﾝ10g？mgですよね。うちでは20mgいれてます。溶液は緑茶色になっていると思います。蒸留水で切片を洗っていざ溶液に。37度で1時間反応で染まってきます。
ご質問では固定・反応温度に触れられていませんがこのあたりの条件はいかがでしょうか？
キットは、お試し染めしたことあります。

[2] mixiユーザー 06月02日 00:46

ありがとうございますｯ(;￫㉨￩)
温度は37度でやっていましたが、固定はしていませんでした！
固定は早速、月曜に試してみたいと思います
あと、濃度が倍なんですネ〆(･Å･`o)ﾉ
(gじゃなくmgでしたｗすいません)

染色液の色が緑茶色？？？
すいませんが、衝撃の事実でした
考えた結果、すごく間違っていることに気づき恥ずかしいあまりです。
フェロシアン化でなくフェリシアン化なんですね！

[3] mixiユーザー 06月04日 23:35

＞かずみん(?)　さん

プロトコール　院内においていたため確認できず、詳しくかけませんで済みませんでした。

大事なところいい忘れました、確かにフェリシアン化カリウムです。試薬調整ですが、
ヨウ化アセチルチオコリン20mg　→　0.1M　マレイン酸（pH６6.0）26mL　→　0.1M　クエン酸ナトリウム　2.0mL　→　0.03M硫酸銅　4.0mL　→　DW　4.0mL　→　0.05M　フェリシアン化カリウム　4.0mL　の順に混ぜてます。（一応マニュアルによると･･･^^；）
多分、緑茶色になるかと。

あと、固定用のホルマリンカルシウム（pH7.4）ですが、
特級ホルマリン10mL　＋　無水塩化カルシウム　1g　＋　DW　90mL　を　１N　NaOHで調整します。　大体、4～5Dropで調整可能かと思います。

ご参考までに頑張ってください。

[4] mixiユーザー 06月05日 21:21

＞しま＠下町　さん

ホントにご親切にアドバイスありがとうございます
固定はホルマリンカルシウムですね
マニュアル本は、何とか何とかゴムとか検査室無いものばかりで