細胞培養コミュのトランスフェクションに関して質問です

はじめまして,よろしくお願いします。

私は学部４回生の学生です。分子細胞を専攻しています。
実験に関して少しばかりお力を貸しいただきたく,今回質問のトピを作らせて頂きました。

現在,私はGFP遺伝子を持つベクターにある酵素の遺伝子を組み込んだプラスミドDNAを3T3-L1細胞へトランスフェクションすることを試みています。方法はデンドリマーを用いたトランスフェクション試薬を使用したものです。
しかしこれが思うようにいきません。結論からいうとGFPの蛍光が出ないのです。トランスフェクション後,細胞からRNAの抽出を行い,RT-PCR→PCRでプラスミドDNAが持つマーカー遺伝子が増幅されるか確かめます。するとマーカー遺伝子はきちんと増幅されています。しかしGFPは全く観察できません。ベクターのみトランスフェクションした細胞はGFPの蛍光が現れます。

GFPのアミノ酸残基数に対して，組み込んだ酵素のアミノ酸残基数が３倍以上あり,それが問題ではないかとは考えているのですが････正直わかりません。(GFPと同じぐらいのアミノ酸残基数のまた上記のとは違う酵素遺伝子を組み込んだプラスミドDNAをトランスフェクションした場合はGFPの蛍光が現れたので)

小さなことでも何でもいいので，突っ込んでください。よろしくお願いします。

コメント(7)

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[1] mixiユーザー 12月25日 00:25

こんばんは。
長さ以外の情報がわかりませんが、、GFPと目的の酵素を融合タンパク質として発現させようとしているんですよね？

3T3-L1細胞は未分化ですか？
脂肪細胞に分化させていますか？
現在の方法で、ベクターonlyならGFPは発現しているとのことですが、導入効率はどのくらいなのでしょうか？

目的の「酵素」を培養細胞で発現させた前例（文献）はありますか？
イギーさんと同じGFPフュージョンでの成功例なら言うことありませんが、他のタグでもよいしタグなしでも。

何か理由があって発現しないとか発現量が少ないこともあるし、理由不明のこともあるとは思います。
ちなみにin flameで入っていることや、ストップコドンが確実にあることは確認してますよね？

大目的がわかればいろんなアドバイスが受けられるかもしれませんが、L1でわざわざ発現させているのだから、目的はL1で発現させることですよねきっと。。

あまりお役に立てずごめんなさい。
何か思いついたらまた書きます。

[2] mixiユーザー 12月25日 02:08

目的酵素をベクターに組み込む時にフレームシフトが起こっているという可能性はないでしょうか？きちんと発現しているかを確かめるため細胞からタンパク質を抽出してウェスタンを行ってみることをお勧めします。

[3] mixiユーザー 12月25日 16:20

＜ちみつこさん，ぱややんさん

早速の返信ありがとうございます！

そうですGFPとの融合タンパク質として発現させようとしています。3T3-L1は未分化です。前駆脂肪細胞の状態です。

ベクターのみの導入効率はだいたい70％です。

前例の論文は無いです。元々3T3-L1が発現している酵素なのですが，それを過剰発現させることも目的なのです。

役に立てずになんてとんでもないです！意見ありがとうございます。

丁度，ウェスタンもやってみようとしてたところです，アドバイスありがとうございます。また何かあったらお願いします。

[7] mixiユーザー 01月31日 21:43

はじめてコメントいたします。
学生時代から現在まで細胞培養に携わっているものです。

＜ひめ+ひめｊｒさん
今回のようにトランスフェクション後の細胞を使ってアッセイをする場合に、
細胞の状態がよかったかどうかを判断する目的でのGFPのコトラは不向きだと思います。

GFPがルシフェラーゼアッセイに影響するかどうかは分かりませんが、
できるだけシンプルな実験系にするためには避けるべきだと思います。
GFPをコトラしたことによる影響を考慮しないといけないと思いますので。

ただし同時に導入するという意味を取り違えていたらスミマセン。
コトラではなく、同じ細胞を使用し、
違うdishでトランスフェクションするのであれば判断材料になると思います。

いわゆる陽性コントロールをとるということですが。
この際のトランスフェクション効率が一定であれば
トランスフェクション自体は問題がないことの証明になると思います。

大したコメントではないですが、参考になれば幸いです。

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