プロトコル　～究極　対　至高～コミュのプラスミド構築～アガロースゲル電気泳動

はじめまして、バイオ系学部4回生です。
いきなりですが質問させていただきます、プラスミドDNA構築に関しての質問です。どなたか何でもいいのでお力を貸してください。

まず問題点を言います。問題点はアルカリ－SDS法によってプラスミドDNA抽出を行った後，DNA濃度定量のためにアガロースゲル電気泳動でプラスミドDNAを流すのですが････バンドが全く出ません。薄っすらとも出ません。マーカーは出ています。

詳細は以下の通りです。
ベクターとインサートを持つプラスミドDNAをそれぞれアルカリ－SDS法によって抽出する。抽出後0.7%のアガロースゲルで電気泳動，DNA濃度定量します。ここではバンドがちゃんと現れて，定量できます。
↓
PCRでインサートを増幅
↓
ベクターとインサートを2種類の制限酵素で切る。
↓
ゲル抽出
↓
ligation
↓
エレクトロポレーション
↓
コロニーPCRでインサートを持ったコロニーを確認
↓
インサートを持ってると思われるコロニーを新しいLB寒天培地へクローニング
↓
LB液体培地へ植菌
↓
アルカリ－SDS法によってプラスミドDNA抽出

という流れの最後でつまずいています。シーケンスにかけるために成功したと思われる大腸菌コロニーから，プラスミドDNA抽出しようするのですが，これができません。

以前ここまで進んだ時はLB液体培地4 mlに植菌して，プラスミド抽出を行いました。そのときもバンドは出なかったのですが，質問できる先輩や教官がいなかったので，使用した液体培地が少なかったと勝手に理由を決め付けてしまいました。よって今回はLB液体培地20 mlで培養して，プラスミド抽出を行ったのですが･････バンドは確認できませんでした。

一応，吸光度計での測定をしてみようと思います。でもそれでもプラスミドDNAが無かったときが恐ろしいので････
液体培地にはすべてベクターが持つ抗生物質耐性の抗生物質を加えて培養しています。のでその培地で増殖するのだから，目的のインサートを持ったプラスミドDNAでないにしても，何らか(例えばベクターとか)のバンドが現れるはず････と考えているのですが。
組換えが成功していたとして，そのプラスミドDNAの大きさは約5200bpです。アガロースゲルは0.7%のものを使用しました。

どうか何か心当たりがあれば教えてください。よろしくお願いします。

コメント(5)

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[2] mixiユーザー 04月23日 12:15

プラスミド抽出にはキットを用いていますか？
キットには溶液を加えなければいけないものがあります。

コロニーPCR後確認をしているので、そこまではプラスミドはあるようですね、
頻繁にODを測定してみたらどうでしょうか。

[3] mixiユーザー 04月23日 13:00

まず最初に確認すべきは抗生物質がちゃんと効いているかです。
出来れば新たに抗生物質を粉末から調製し直し、正しい濃度で使えているか確認したほうがいいです。

コロニーPCRを行うときはベクター側（マルチクローニングサイトの外側）のプライマーでPCRをかけるか、ベクター内とインサート内のプライマーを組み合わせて用いましょう。インサートを増幅させる為に使ったプライマーで行うと偽陽性を拾いやすいです。

あと、プラスミドを調製した後まず行うのはOD260による濃度測定だと思いますが。
それによってDNA濃度を調べないとどれだけ電気泳動すれば見えそうかわからないでしょう。
ODを計って濃度を決めてから、泳動により正しいサイズに作成できているか確認し、（出来れば適当な制限酵素で切ってバンドパターンを調べ、）場合によっては再度PCRでインサートをチェックした上で、合っていそうならシークエンスをチェックするという順序で行うべきです。

[4] mixiユーザー 04月23日 16:42

みなさんアドバイスありがとうございます。

＞1　あおさん
抗生物質はカナマイシンです。濃度は30 μg/mlです。
発現ベクターです。
植菌してから16時間培養しています。

＞2　たつさん
プラスミド抽出はキットではなく，フェノール･クロロホルムとエタノール沈殿で行っています。

＞3　96さん
抗生物質に関しては確認しみます！
コロニーPCRで使ったプライマーはインサートを増幅したものと同じものを使っています。偽陽性なるものを持ったコロニーが存在するということですか････分かりました！何とかベクター側からくっつくプライマーを注文してみます！

OD260で濃度測定したところ，濃度は十分にありました。
どうも私の研究室では，DNAの濃度定量は電気泳動写真からバンドの濃さをマーカーと比較して行うのが通常のようでして，以前OD260で測定した濃度をレポートに載せたら，正確ではないという理由でお叱りを受けました。
以来，OD濃度測定はコソっと隠れてやっております