薬学生の薬学勉強会コミュの放射化学　『タンパク質標識法』

『タンパク質標識法』

目的：たんぱく質の放射性同位体の標識法として代表的な直接法によって検定する。

理論：一般にたんぱく質は同位体標識が困難であるので、放射性ヨウ素による非同位体標識物がトレーサーとして使用される。たんぱく質は熱やPhに対して著しく敏感で容易に変性するので、標識にいたっては変性を避けるために緩和な条件が要求される。この実習では、ヨウ素陰イオンをクロラミンTで参加して生成する活性ヨウ素によるたんぱく質のヨウ素標識法（クロラミンT法）である。この直接法ではヨウ素はチロシンのフェノール核の水酸基のオルト位、ヒスチジンのイミダゾール環、またトリプトファンのインドール環に容易に反応する。

試料：１３１ヨウ化ナトリウム（Na１３１I）水溶液、牛血清アルブミン（BSA）水溶液

実験：
?BSA水溶液０．１ｍｌをプラスティックチューブに入れる。
?これに０．５Mリン酸緩衝液（PH７．４）０．１ｍｌを加える。
?Na１３１I水溶液０．１ｍｌを加える
?クロラミンT液０．４ｍｌを加えて３０秒軽く振る。
?メタ重亜硫酸ナトリウム液０．４ｍｌを加えて混ぜた後、ヨウ化カリウム水溶液を入れて液が着色していないことを確認する。
＊着色していた場合は無色になるまでメタ重亜硫酸ナトリウム液を加える。
?反応液を薄層クロマトプレートの上にGMサーベイメーターで確認しながらガラスの毛細管でスポットする。
?薄層プレートをメタノール：水（７５：２５）によって、上端より数センチまで展開する。
?薄層プレートを室温で乾燥後、原点より1センチ間隔でハンディGMによって２分間放射能を測定し、ヒストグラムを作成する。

＊?の操作を行うと、活性のヨウ素が発生するので大変危険である。よってこれらの動作はドラフト内で行う。

結果：

Ｂ．Ｇ＝４．３ｃｐｍ（10分間で４３ｃｐｍ）

問題：
１、原点にとどまっている１３１I標識ＢＳＡと移動したＮａ１３１Ｉの放射能を、作成したヒストグラムから求める。

★１３１I標識ＢＳＡ＝１４１ｃｐｍ＝Ｄ１
★Ｎａ１３１Ｉ＝２０２ｃｐｍ＝Ｄ２

２、得られたＤ１とＤ２から放射化学的収率を求める。

放射化学的収率（パーセント）＝Ｄ１／（Ｄ１＋Ｄ２）×１００

★放射化学的収率＝４１．１％

３、ＢＳＡの分子量を７００００としてＢＳＡ１分子に結合した１３１Ｉ原子数を求める

☆重要な式

Ｄ＝λＮ　…?
Ｄ：放射能
λ：壊変定数
Ｎ：分子、原子の個数

Ｔ＝ｌｎ２／λ　…?
Ｔ：半減期
λ：壊変定数

?と?を利用して計算していく。
まず、ＢＳＡと結合した１３１Ｉの放射能は

Ｄ＝４２６．２×１０３（Ｂｑ）×０．４１１

４２６．２×１０３（Ｂｑ）は添加した１３１Ｉ全ての放射能（Ｎａ１３１Ｉの比放射能は４．２６２ＭＢｑ/ｍｌでこれを０．１ｍｌ使ったから）で、０．４１１は２で計算した放射化学的収率である。

また?式より壊変定数λを求める（１３１Ｉの半減期は８．０２１Ｄ）。

これらを?に代入すると、ＢＳＡに結合した１３１Ｉは１．７５×１０１１個となる。

またＢＳＡの個数は、

（１．０×１０－４×６．０２×１０２３）／７００００＝８．６×１０１４個となる。
＊今回使用したＢＳＡは１．０×１０－４g。

よって、結合した１３１Ｉの数をＢＳＡの数で割るとＢＳＡ１個あたりの結合数がわかる。

∴２．０４×１０－４個

４、たんぱく質の標識法として他にどのような標識法が存在するか。

★間接標識法：あらかじめ１２５Ｉ等で標識した試薬をたんぱく質に結合させる間接的標識法である。

☆よく使用される試薬：Ｄｅｎｎｙ－Ｊａｆｆｅ試薬、Ｂｏｌｔｏｎ＆Ｈｕｎｔｅｒ試薬

これらの試薬はたんぱく質のＮ末端アミノ基またはリジン側鎖のアミノ基などと縮合し、１２５Ｉで標識されたフェニル基がアミド結合を介してたんぱく質と結合するのでチロシンやヒスチジン残基のないたんぱく質にも有効である。また操作も簡単で酸化剤を使用しないのでヨウ素ガスも発生せず安全である。

☆Ｄｅｎｎｙ－Ｊａｆｆｅ試薬によるレセプター標識法

この標識試薬がレセプターに結合すれば、３６０nmのＵＶを照射することによってレセプターたんぱく質に架橋することができる。この状態で、架橋構造を確認した後ハイドロキシサルファイト処理、ＳＤＳ処理すると標識核種の結合したフェニル基がレセプターにくっついた構造が得られる。ＳＤＳ処理でフェニル基以外の試薬は遊離する。