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Materials
1. 32Ｐで標識して欲しいDNA断片 (DNA プローブ) を１ｘTEバッファー (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) に溶液する
2. OLB バッファーの作り方
溶液A: 1.25M Tris-HCl, pH 8.0, 0. 125M MgCl2 (store at 4°C).
溶液B: 1 mL 溶液A, 18 µL 2β-mercaptoethanol (2βメルカプトエタノール), 5 µL of dATP,* 5 µL of dTTP,* 5 µL of dGTP.*
溶液C: 2M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)の溶液に, 滴定でpH 6.6 になるまでに4M NaOH を滴下する(store at 4°C).
溶液D: HexadeoxyribonucleotidesをTEに溶解する, pH 8.0, at 90 OD260 U/mL (store at -20°C).
OLB bufferを作るために, B溶液とC溶液とD溶液を100:250:150の割り合いに混ぜる。
Store OLB at -20°C.
3. A nucleotide labeled at the a position with P-32, (例:32P dCTP);SA 3000 CilmM. Store at -20°C.
4. Klenow (1 U/µL). Store at -20°C.
5. 10 mg/mLの Bovine serum albumin (BSA)を蒸留水に溶解する
*各ヌクレオチド(nucleotide) を 3 mMTns-HC1,0.2 mM EDTA, pH7.0, 0.1M にあらかじめ溶解する。
Methods
1. 30 ng のDNA プローブをチューブに移し、蒸留水を全体量31 µLになるように加える。
2. 三分間DNAミクスをボイルすると、チューブを氷上に置く。
3. 10 µL OLB buffer, 2 µL の10 mg/mL BSA, 5 µL labeled nucleotide, 2 µL Klenow fragmentを加え、ピペットマンで静かに混ぜる。
4. 4-16 時間室温でインキュベートする。
できた！
Smith R. D. (1996) Random Primed 32P-Labeling of DNA .Basic DNA and RNA Protocols Methods in Molecular Biology, Volume 58, Part I, 27-29.
http://www.springerlink.com/content/g7508053723370j2/#section=90154&page=1&locus=94
1. 32Ｐで標識して欲しいDNA断片 (DNA プローブ) を１ｘTEバッファー (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8.0) に溶液する
2. OLB バッファーの作り方
溶液A: 1.25M Tris-HCl, pH 8.0, 0. 125M MgCl2 (store at 4°C).
溶液B: 1 mL 溶液A, 18 µL 2β-mercaptoethanol (2βメルカプトエタノール), 5 µL of dATP,* 5 µL of dTTP,* 5 µL of dGTP.*
溶液C: 2M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)の溶液に, 滴定でpH 6.6 になるまでに4M NaOH を滴下する(store at 4°C).
溶液D: HexadeoxyribonucleotidesをTEに溶解する, pH 8.0, at 90 OD260 U/mL (store at -20°C).
OLB bufferを作るために, B溶液とC溶液とD溶液を100:250:150の割り合いに混ぜる。
Store OLB at -20°C.
3. A nucleotide labeled at the a position with P-32, (例:32P dCTP);SA 3000 CilmM. Store at -20°C.
4. Klenow (1 U/µL). Store at -20°C.
5. 10 mg/mLの Bovine serum albumin (BSA)を蒸留水に溶解する
*各ヌクレオチド(nucleotide) を 3 mMTns-HC1,0.2 mM EDTA, pH7.0, 0.1M にあらかじめ溶解する。
Methods
1. 30 ng のDNA プローブをチューブに移し、蒸留水を全体量31 µLになるように加える。
2. 三分間DNAミクスをボイルすると、チューブを氷上に置く。
3. 10 µL OLB buffer, 2 µL の10 mg/mL BSA, 5 µL labeled nucleotide, 2 µL Klenow fragmentを加え、ピペットマンで静かに混ぜる。
4. 4-16 時間室温でインキュベートする。
できた！
Smith R. D. (1996) Random Primed 32P-Labeling of DNA .Basic DNA and RNA Protocols Methods in Molecular Biology, Volume 58, Part I, 27-29.
http://www.springerlink.com/content/g7508053723370j2/#section=90154&page=1&locus=94
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