mixi核磁気共鳴【NMR】学会コミュのNMRによるタンパク質の解析について

はじめまして。最近NMRに手を出した初心者です。

実は他のコミュでも似たような質問してしまっています。

こっちを先に知っていれば・・・

今ちょっと切羽詰まってるのでどうかご容赦ください。

現在、タンパク質と低分子化合物の相互作用をNMRのHSQC測定により解析しています。少し詳しく言うと、変異体をいくつか作成し、変異体ごとに、低分子化合物添加の応答を残基毎に追って解析しています。

しかし、15Nでラベルしたタンパク質を使っていますが、あるはずのアミノ酸のピークが数個、全てのサンプルで検出されません。そのアミノ酸というのは、Gly、Ser、Thrなんですが、全て低分子化合物自体と直接は相互作用しない位置にあります。以前は見えていたのですが・・・

以前と違うのは、pHを少し変えたのと、バッファーを重水素置換のものからphosphate bufferに変えたことです。

ピークの重複ならintensityが異常に高いピークが出てくると思うのですが、そういったものは見られません。

見えなくても構わないのですが、原因が知りたいです。

また、参考になる本等ご紹介いただけると幸いです。

長々と申し訳ありません。

よろしくお願いします。

コメント(6)

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[1] mixiユーザー 12月10日 01:18

タンパク質には詳しくありませんので、的外れな発言になってしまうかもしれませんが・・・

（１）ピークが消失したのが、条件を変えた後（低分子化合物添加前）

→条件の変更により、タンパク質の性質が変わり、それが原因でピークが消失

（２）条件を変えた後は見えていたが、低分子化合物添加後に消失

タンパク質と低分子化合物が相互作用することにより、
低分子と直接相互作用していない部位も構造変化を起こし、それが原因でピークが消失

がまず考えられるのではないでしょうか？

pH・バッファー変更により、分子間の親和性が変わる可能性は大いにあります。
実験途中で実験条件を変えた場合は、
ゲルシフトアッセイなどで、条件の違いにより親和性が変化するかを確認しなくてはいけないと思います。

[2] mixiユーザー 12月12日 12:08

ご回答ありがとうございます！！

少し説明不足だったようです。

今回の現象は（１）の時点で確認されました。低分子添加前なので、「タンパク質と低分子が・・・」ということはなさそうですね。

補足ですが、「以前」というのは卒業生のデータを指していたのですが、当時はpH5.0の重水素置換bufferにてNMR測定を行っています。しかし、その卒業生も私もタンパクの精製にはphosphate buffer (pH 7.4 、私はNMR測定にもこのphosphate bufferを使っています)を使用しているので、条件の変更が原因なら、その変化は可逆的なものなのでしょうね。

また、今回の現象は、卒業生も私も行った同じ野生型での測定結果（卒業生：pH5.0の重酢酸、今回：pH7.4のPBを使用。両者とも低分子添加前のデータ）を比較して分かったことですが、ピークの消失以外にもほとんどの残基のピークが微妙にシフトしていました。

なので、両者間でコンフォメーションが多少変化していることが予想できますし、「条件の変更により・・・」というのは十分考えられそうです。

ただ、その原因を調査するための実験、行いたいんですが、
できなさそうなんです。

今あるデータで相互作用は解析できてしまっていますし、
何より時間がないので・・・

しかし、HSQCにおいて、15Nラベルされているタンパク質ならばアミノ酸残基が数個だけ見えないということは原理上起こり得ないように思うのですが、どうなのでしょう？

追加質問になってしまい申し訳ありません。
NMRの知識はほんとに乏しくて・・・

気付いたときで構いませんので、
どうぞ御回答の程よろしくお願いいたします。

[3] mixiユーザー 12月13日 02:31

私もASTROJAXさんがおっしゃられているようにコンフォメーション変化によるものだと思います。

バッファー条件（特にpH）を変えると化学シフト変化がおこるのは、各アミノ酸残基のまわりの化学環境が変化することから当然のことといえます。BMRBに、同じ蛋白質でも複数の化学シフトが登録されているのもおそらくこの理由です。

重水素化バッファーとリン酸バッファーについてですが、両者とも非交換性のプロトンをもたないというところがいいところなので、役割の違いはあまりないのではないかと思います。

ですので、前任者となぜバッファー条件を変更したのかわかりませんが、前任者のHSQCスペクトルとしんさんのHSQCスペクトルを比較するのはあまり意味のないことだと思われます。

さて消失した残基ですが、蛋白質中のすべてのGly、Ser、Thr残基のスペクトルが見えないということでしょうか？
それだとちょっと理由がわからないのですが、特定のGly、Ser、Thr残基のことだとすれば、立体構造が出されている蛋白質であれば、マッピングしてみるのはいかがでしょうか。ループ部分や金属結合部位などであれば、その部位はフラフラして１つの構造をとらず、複数のコンフォメーションをとることによってHSQCスペクトルがブロードニングして、ピークが観測されないということはよく起こります。

もう解析は済んでいるとのことですが、ピークが見えないのは気持ち悪いということであれば、蛋白質試料を前任者と同じバッファーに交換して、HSQCをはかってみてはいかがでしょう。バッファー交換は量にもよりますがアミコンウルトラで１時間もあればできますし、HSQCも１時間測れば十分です。

参考資料を挙げておきますね。（直リンクしていいのか不明なので、場所の説明だけ）

・ＮＭＲ測定試料作成のマニュアル（九州大学　神田先生）
http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/vsb/index.html
から、日本語→技術資料→ＮＭＲサンプル調製法のpdf
バッファー条件の検討について詳しく書かれています。

・NMRによる相互作用解析
分子間相互作用解析ハンドブック―タンパク質とタンパク質・核酸・糖・脂質・低分子間のネットワーク解析 (実験医学別冊 19)
タイトレーション法、交差飽和法についての解説とやり方が載っています。
この項の執筆者も神田先生です。

修論提出が近いようですが、頑張ってください。

[4] mixiユーザー 12月19日 12:08

>indigoさん

御返答ありがとうございます。
少しどころか全然説明不足でしたね。

・・・

さて、
Gly、Ser、Thrについてですが、おっしゃる通り特定の残基です。
見えなくなったのは全部で5つあるのですが、内3つはループの先端にあります。
この3つについては、私もフラフラが原因だろうと予測はしていたのですが、
残りの2つはループの根元にあります。

なのでフラフラ以外の5残基に共通の理由があるのだろうと思い
いろいろ調べてみたんですがやっぱり分からず・・・という経緯です。

ちなみにbuffer交換したのは単にお金の問題です。

参考資料、非常に助かります。
本当にありがとうございます。

[6] mixiユーザー 12月20日 12:30

>ぷーやんさん

ご回答ありがとうございます。
皆さんなんて親切なんでしょう。
うちにはドクターがいないんで、本っ当に助かります。

参考テキスト、是非活用させて頂きます。

追加質問になってしまうのですが、

今回の現象はやはり、pHを変えたことが原因のようですが、
僕が扱うタンパク質の中で、最も長く動きも一番大きなループにはそういった現象は見られなかったり、他にも消失した5つの残基と似た環境にある残基は何個もありそうなのにいつも同じ5残基が消失、というのは何故なんでしょうか？

消失した5残基は、

Gly2個がループの先端、
Ser 1個が別のループの先端、
Thr、Ser１個ずつがその一番大きなループの根元

を形成しています。
しかし、ループ先端のGlyは何個もありますし、ループの根元はそんなにフラフラはしていないと思うので、ただ外向きが原因ならばそれこそ何個もあります。

なので、「その5残基だけ」というのは・・・？
それとも周囲のアミノ酸の影響もあったりするのでしょうか？異方性効果？

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