みんなおいでよ応化の森コミュの生物化学?だぉ(〃^∇^)o_彡☆

＜目的＞
　生化学成分の分離・同定の手段としてゲル電気泳動が汎用されている。電気泳動とは「電荷を有する分子やコロイド粒子などが電場中で移動する現象」であり、ゲルのような網目構造を有する環境場中で電気泳動を行うと、移動する分子（粒子）が網目環境場中で「分子ふるい」の効果により移動し、移動速度はサイズ（分子量）の影響を受けて分離が起こる。
　このようなゲル電気泳動は、タンパク質の分離・分析や核酸の塩基配列の決定などのために今日でも広く利用されており、また、各種クロマトグラフィーや高度な電気泳動法の基礎となっている。



























＜原理・理論＞
　１電気泳動について
電気泳動は、電荷を有するタンパク質分子などを電解質溶液中に入れ、２本の電極を溶液中に差し込み、直流電流をかけると、正に電荷した分子は陰極へ、負に電荷した分子は陽極へ移動を始める現象である。Qという電荷を持ったタンパク質分子AをHという電位勾配をもった電場に置いた時、AはｑHという力でｑの電荷と反対符号の電極の方向に引かれる。液体中で分子は速度が大きくなるにつれて大きな抵抗力Fを受け、ついには次式の条件で一定速度となる
qH=F (1)
　この時、電場における分子の移動し易さを示すために移動度uが移動速度ｖを用いて定義される。移動速度をv[cm/sec]とすると、u（1V/cmの電位勾配のもとでの移動速度）は次式で表される。

u=v[cm/sec]/H[V/cm] (2)

　qはさらに粒子の持つ電荷数zと電子電荷eの積で表すことができる。
Q=z・e (3)
　したがって電気泳動の際の駆動力は分子の持つ電荷量と電位勾配に比例することがわかる。また、抵抗力Fha速度vで移動する分子Aが単位時間内に衝突する静止した分子Bの分子量MBと個数ｎBに比例するはずであるから
　F=k・MB・nB (4)
さらに衝突する分子Bの個数ｎBは両分子を剛球体として衝突断面積を考えると
ｎʙ=πrAB²・Cʙ・V　　　(5)
と書き直せる。ここでｒABは分子Aの半径ｒAと分子Bの半径ｒBの和、CBは分子Bの濃度である。したがって抵抗力Fは
F=k・Mʙ・πrAB²・Cʙ・A (6)
と表す事ができる。すなわち、電気泳動の際には抵抗力は、分子Aの速度ｖに比例し、分子AとBの衝突断面積πrAB²(ぶんしAがBに比べて十分大きければAの断面積)および分子Bの濃度Cʙに比例することとなる。しかし、通常の溶液について電気泳動を行うと対流の発生によって乱れが生じる。対流が生じると試料中に存在する多くの成分を分離することは望めない。そこで、ゲルのような網目構造を有する環境場中で行うと、移動する分子は網目環境中で「分子ふるい」の効果により、移動速度はサイズの影響を受けて分離が起こる。



＜原理・理論＞
　２PAGE（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）について
アクリルアミド（AAｍ）と適量の架橋剤（通常N,N’−メチレンビスアクリルアミド　BIS）を緩衝液に溶解して、重合開始剤（通常過硫酸アンモニウム　APS）
と重合促進剤であるテトラメチルエチレンジアミン（TMEDA）を添加し重合させると、透明な共重合ゲルが形成される。TMEDAは過硫酸イオンと反応し、両者に不対電子が持ち込まれ次々に重合反応が促進される。また、AAｍ単独では一本の紐状に重合した水溶性高分子（ポリアクリルアミド　PAAｍ）となるが、添加したBISが架橋剤として働くため、ブロック状のPAAｍゲルが得られる。このゲルが化学的に安定であり、以下のような特徴を有する。
1) 生成したゲルは無色透明であり染色後のバックグラウンドにおいても維持される。
2) 機械的強度に富むが比例的にフレキシブルでありハンドリングが用意である
3) AAｍや架橋剤の混合比率を調製することによって試料にてきした分子ふるい効果が得られる。
4) 高純度の単量体が得られる事から、電荷を持たないゲルの網目を調製できる。これにより電荷を帯びた粒子を結合あるいは排除しないにで純粋に「分子ふるい」として機能することができる。されに、電荷を持たないことで電気浸透現象によるゲル内の溶媒の流れとを生じない。
5) 高いｐH範囲での様々な種類の緩衝液を使用できるばかりでなく、SDSや尿素などのタンパク質変性剤を共存させることができる。
6) ゲルが比較的親水性であるため核酸やタンパク質を吸収しない。

　ゲル濃度（架橋密度）を変化させて電気泳動を行うと、ゲル中の電気泳動移動度uと自由溶液中の電気泳動移動度u₀,そして、ゲル濃度TCの間には次式のような相関が経験的に得られる

u=u₀exp(-kRTC) (6)
log u=logu₀-kRTC (7)
（kR=遅延係数）





＜原理・理論＞
３タンパク質について
生物体の主要構成成分であるタンパク質は、約20種類のL-α-アミノ酸がペプチド結合により連結した一本のポリペプチド鎖から成る。
　タンパク質により構成アミノ酸の数・種類、配列順序が異なり、分子量も異なる。従ってタンパク質を攻勢するアミノ酸の塩基性アミノ酸が多ければ正に、酸性アミノ酸が多ければ負に帯電する。電荷数が見かけ上釣り合った点を等電点と言い、等電点を境にして酸性側では正に、塩基性側では負に帯電する
　タンパク質は、一次から四次までの高次構造をとりその上体により分子サイズが異なる。　
　一次構造は、アミノ酸の配列順序であり、アミノ酸間のペプチド結合によってポリペプチド鎖が形成される。α−アミノ基を持つN-末端、カルボキシル基をC-末端と言う。
　二次構造は、ペプチド鎖中のC=O、N-H基が繰り返しのある規則性をもって結合・配向したα−ヘリックスやβシート、ｓｐしてランダムコイル構造などをいう。
　三次構造は、αヘリックス、βヘアピンなどの超二次的構造を各にさらにジスルフィド結合などによって構造的、機能的にまとまったドメインをいう。
　四次構造は、さらに高次に複数のポリペプチド鎖が会合し、空間的は位置をとる。各ポリペプチド鎖をサブユニットとよび、二量体や四量体などが存在する。